Регуляция активности тромбоцитов включает множество сигнальных молекул, контролирующих все стадии этого весьма сложного процесса. Среди известных активаторов тромбоцитов наиболее хорошо изученными мощными активаторами являются тромбин, коллаген, АДФ, тромбоксан А2, серотонин и другие. Пути активации тромбоцитов данными факторами разнообразны. Одним из сильных блокаторов активации тромбоцитов является простациклин группы простагландинов.
Активированные тромбоциты освобождают и/или связывают все компоненты, необходимые как для ускорения, так и для ингибирования активации протромбина в тромбин. Более того, активированные тромбоциты взаимодействуют с клетками эндотелия, гемопоэза, базальной мембраной и другими субэндотелиальными структурами, что при эффективном контроле обеспечивает нормальный гомеостаз, заживление ран, ограниченное воспаление и ряд других морфогенных перестроек. Однако при нарушении активации тромбоцитов усиление взаимодействия активированных тромбоцитов с указанными структурами может приводить к выраженной патологии, что обусловливает в дальнейшем развитие и распространение атеросклероза и опухолей.
В настоящее время получены данные об участии сфинголипидов в регуляции активности тромбоцитов, однако, их роль в этом процессе изучена недостаточно. Многочисленные сведения позволяют с уверенностью судить только о роли сфингозин-1-фосфата(Sph-1-Р) в контроле активации тромбоцитов, в то время как данные о роли других липидов этой группы, особенно комплексных сфинголипидов, крайне ограничены. Поэтому настоящий обзор посвящен анализу участия комплексных сфинголипидов в регуляции активности тромбоцитов, а также их метаболизму в мембране тромбоцитов.
Что такое сфинголипиды?
Сфинголипиды – отдельный класс молекул, включающий в себя более трех тысяч наименований, имеющих общее структурное основание – сфингозин (Sph). Сфинголипиды обнаружены во всех типах клеток, поддерживают структуру и функциональную активность плазматической мембраны, ядра и органелл. Сфинголипиды регулируют функциональную активность сердечно-сосудистой системы и тромбообразование. Экспортируемые тромбоцитами сфинголипиды Sph-1-Ри сфингозинфосфохолин обладают вазоконстрикторными свойствами и модулируют сократительную активность гладкомышечных клеток сосудов. Сфингозинфосфохолин действует как провоспалительный медиатор в этих клетках [31]. Одна из важных функций сфинголипидов в тромбоцитах – это участие в ответе на стресс.
Все сфинголипиды можно условно разделить на простые и комплексные. Простые сфинголипиды – Sph, сфинганин, фитосфингозин, церамидид (Cer), являются регуляторными молекулами и проводят сигналы внутри клеток. Все комплексные сфинголипиды являются сфингогликоконъюгатами, в которых Cer соединяется амидной связью с различными головными группами, которые и дают названия комплексным Sph: сфингомиелины, ганглиозиды, цереброзиды, сульфатиды и т.д.
Сфингомиелин (SM) локализуется во внешнем бислое плазматической мембраны и является её основным липидным компонентом: на долю SM приходится ~ 13% всех липидов или ~ 21% всех фосфолипидов плазматической мембраны тромбоцита [23]. Содержание SM в мембране тромбоцитов и эритроцитов практически одинаково и намного превышает концентрацию SM в лимфоцитах, нейтрофилах и в мегакариоцитах [13]. Сопряженный с холестерином SM формирует липидные рафты и кавеолы (см. далее), а также входит в состав мембран всех органелл в клетке. SM является связующим звеном практически всех сигнальных путей, инициируемых на плазматической мембране, а также источником биологически активных липидов.
Гидролиз SM в плазматической мембране, катализируемый сфингомиелиназой (SMase), называется сфингомиелиновым циклом, в результате которого образуется Cer, из которого, в свою очередь, образуется Sph; церамид и сфингозин могут фосфорилироваться в, соответственно, церамид-1-фосфат (Cer-1-Р) и Sph-1-Р, которые дают начало собственным сигнальным путям.
В тромбоцитах обнаружен крайне низкий уровень биосинтеза сфинголипидов, поэтому простые и комплексные сфинголипиды импортируются. SM, фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (PE) переносятся из липопротеидов (ЛП) с помощью специальных белков – переносчиков на поверхность тромбоцита, где SM под действием SMase конвертируется в Cer и далее в Sph.
В экспериментах с радиоактивным SM было показано, что транспортерами [3H]SM являются два белка – основной белок тромбоцитов, а также хемокин СТАР-III (Connective TissueActivating Peptide). СТАР-III – медиатор селективного, независимого от эндоцитоза транспорта SM из ЛП низкой плотности (ЛПНП) в клетки крови, он специфически стимулирует перенос исключительно [3H]SM, но не РС или РЕ, из ЛПНП на мембраны клеток крови. Энергия активации предполагает встраивание SM в гидрофобное микроокружение. Каталитическое действие СТАР-III блокируется гепарином. Импортированный [3H]SM быстро гидролизуется с образованием Cer и Sph, что позволяет модулировать сигнальные пути сфинголипидов. Обмен [3H]SM между липидными везикулами и тромбоцитами ускоряет супернатант, полученный от тромбоцитов, активированных тромбином [35].
При переносе SM из ЛПНП через 5 минут уровень Cer достигает 4,5нМ х 106 тромбоцитов.
По сравнению с другими клетками, тромбоциты преимущественно конвертируют исходный SM в Sph-1-P. Пик уровня Sph достигает максимума через 10 минут, а уровень Sph-1-P повышается в 20 раз по сравнению с контролем. Если сравнивать с клетками фибробластов хомячков, то в них наблюдается только 2-кратное повышение уровня Sph и Sph-1-P через 30 минут, что возвращается к исходному уровню через 3 часа [38]. Тромбоциты – основной источник Sph-1-P в сыворотке крови. При активации тромбоциты выделяют тромбин и Sph-1-P, которые синергично повышают синтез тканевого фактора (TF) клетками эндотелия. Sph-1-P потенцирует тромбин-зависимую продукцию TF на уровне транскрипции. При потенцировании действии тромбина Sph-1-P активирует сигнальный путь с участием киназ ERK1/2,
NF-kB, а также повышает экспрессию генов edg-1 и edg-3. Действие Sph-1-P на тромбоциты специфично и не заменяется эффектами лизофосфатидной кислоты, лизофосфатидилхолина, Sph или С2-церамида [37].
В тромбоцитах образование [3H]SM из экзогенного [3H]Sph показано в любых условиях, однако, из Sph преимущественно образуется Sph-1-P, и только при его избытке начинается синтез de novo (Sph>Cer>SM) [16, 43]. Так как синтез сфинголипидов de novo в тромбоцитах составляет не более 5% от нормы, но потребность в комплексных сфинголипидах высока, поэтому синтез их начинается со SM, адсорбируемого из ЛП. В тромбоцитах кролика SM селективно ингибирует активность 12-липоксигеназы, снижает формирование 12-гидрокси-5,8,10,14-эйкозатетраеновой кислоты, немного повышает уровень тромбоксана В2 и образование 12-гидрокси-5,8,10-гептадекатриеновой кислоты [11].
Липидные микродомены и их роль
в передаче сигналов в тромбоцитах
Плазматическая мембрана клеток млекопитающих включает в себя комплексные гликолипиды, сфинголипиды, гликопротеины и другие макромолекулы, подвижное состояние которых позволяет оптимально отвечать на экстраклеточные сигналы. Гликосфинголипидные микродомены диаметром 40–100 нм, выделяемые во фракции ЛПНП при градиентном центрифугировании мембран клеток, обработанных неионными детергентами, и обогащенные SM и холестерином (ХС), называются рафтами. Соотношение ХС и SM в детергент-резистентной мембранной фракции составляет 50% к 20%. В настоящее время существует разграничение рафтов от кавеол, последние формируются путем связывания мембранных сфинголипидов олигомерным комплексом кавеолина-1. В обоих случаях – это особое состояние плазматической мембраны, структурную основу которого формируют ХС и SM, а образованный из SM церамид создает условие для изменения физических свойств мембраны и для фазовых переходов [33].
Латеральная сегрегация доменов происходит при изменении физико-химических свойств мембраны и дает возможность концентрировать в липидных микродоменах рецепторы и ассоциированные с ними киназы и фосфатазы, необходимые для проведения сигналов в клетку. Электропроводимость плазматической мембраны клеток зависит от соотношения липидов в рафтах, снижается в присутствии липидов из рафтов по сравнению с другими липидами клетки, которые преимущественно создают жидко-ориентированную фазу в мембранах. Латеральная диффузия снижается при добавлении в мембрану агрегатов пептидов [9].
Критичным для поддержания рафтов является соотношение липидов, прежде всего, отношение уровня ХС к SM, а также содержание фосфолипидов [15]. Активация сфингомиелинового цикла и градиентное локальное накопление церамида обусловливает изменение структуры липидных микродоменов и физических свойств плазматической мембраны. Церамид регулирует образование кластеров рецепторов на поверхности мембраны после распознавания лигандов, регулирует кеппинг и формирование эндосом.
Потеря 35% всего ХС тромбоцитов соответствует потере 75% ХС рафтов, что полностью блокирует связывание специфических маркеров с рафтами [39]. Потеря ХС приводит к снижению длительности агрегации тромбоцитов при стимуляции АДФ через сопряженные с G-белками рецепторы, которые обозначаются как P2Y1 и P2Y12, и снижает P2Y12-зависимое ингибирование образования цАМФ в тромбоцитах. Восстановление уровня ХС после его потери восстанавливает АДФ-зависимую агрегацию тромбоцитов. Снижение уровня ХС в плазматической мембране на 50% ингибирует образование Cer и сигнальный путь JNK киназы (c-Jun Nuclear Kinase) [7].
Статины, в частности розувастатин, оказывают влияние на взаимодействие тромбоцитов с активированными субстратами. В эксперименте были отобраны тромбоциты, полученные после перфузии крови через коллаген I типа, эти тромбоциты были далее адсорбированы на различных белках и затем подвергнуты двухмерному электрофорезу. Блокада 3-гидрокси-3-метилглютарил-коэнзим-А редуктазы существенно снижает депонирование тромбоцитов и модулирует экспрессию 18 белков тромбоцитов, в том числе ингибирует перемещение стрессового белка GRP78 (Glucose Related Protein 78), в норме сопряженного с эндоплазматическим ретикулумом, и его экспрессию на поверхности тромбоцитов после активации коллагеном, где он взаимодействует с TF. Если заблокировать перемещение GRP78 на поверхность тромбоцита, то значительно повышается прокоагулянтная активность TF и снижается время ретракции сгустка [29].
Флуоресцентная краска 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetra-methyl-indocarbocyanineperchlorate (dil-С (18:0)) преимущественно встраивается в гель-подобные липидные домены, что позволяет визуализировать фазовый переход в липидных мембранах. В липидной смеси ионного липида 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), SM и ХС, краска dil-С (18:0) распределена негомогенно при t°+24°С, но не при t°+37°С, что отражает фазовое изменение мембраны тромбоцитов и предполагает возможность формирования больших липидных доменов при низкой температуре, так как макроскопические домены появляются в наружном бислое плазматической мембраны тромбоцитов только при низкой температуре. Падение уровня ХС в тромбоцитах на 15 М% критично для формирования больших доменов при снижении температуры окружающей среды [3].
При активации тромбоцитов человека холодом или агонистами, рафты соединяются в видимые агрегаты, что может быть нарушено снижением концентрации мембранного ХС. Фазовый переход в тромбоцитах наступает при t°~ +30°С, что определено как переход рафтов из жидко-ориентированной фазы. Следующий фазовый переход может быть при t° ~ +15°С. Снижение уровня ХС в мембране тромбоцитов обусловливает фазовые переходы при значительно более высокой температуре. Агрегация рафтов – динамический, обратимый физиологический процесс, инициируемый при активации тромбоцитов [14].
В рафтах плазматической мембраны специфически локализуются рецепторы к мускарину и брадикинину-В2, a- и b-адренергические рецепторы, рецептор PDGF (Platelet DerivedGrowth Factor), рецепторы хемокинов, Ca2+ активированные K+ каналы, белки, ассоциированные с кальциевыми сигналами. Ряд рецепторов и сигнальных молекул могут локализоваться как в рафтах, так и в кавеолах: к ним относятся ангиотензин II, серотонин, окситоцин, рецептор EGF (Epidermal Growth Factor), вольтаж-зависимые K+ каналы, протеинкиназа С (PKC), фосфолипаза С (PLC). Специфическая локализация рецепторов и сигнальных молекул только в кавеолах показана для АТФ-чувствительных K+ каналов, Ca2+ чувствительных рецепторов, холецистокинина, эндотелиальной NO-синтазы, эффектора Ca2+ сигналов Homerи ряда других молекул [32].
Комплекс GpVI/FcgRIIa – один из рецепторов коллагена на тромбоцитах. Активация тромбоцитов через GpVI/FcgRIIa происходит в тех микродоменах, где имеются все специфические белки данного сигнального пути. При связывании рецептора FcgRIIa повышается уровень церамида, изменяется физическое состояние мембраны, в рафты перемещаются РКСd и Raf-1, активируется сигнальный путь МАРК (митоген-активированной протеинкиназы), что регулирует фагоцитоз. Сфингомиелиновый цикл необходим для проведения сигналов в тромбоцитах при контакте с бактериями. Взаимодействие с тирозинкиназой Syk сопрягает сигнальные пути GpVI и белков цитоскелета [36].
Рецептор FcgRIIa тромбоцитов ко-локализуется в липидных рафтах с другими рецепторами (RhoA и ARF1) и ферментами, в частности, с фосфолипазой D (PLD). Гетеротримерные G-сопряженные рецепторы также находятся в рафтах. Здесь же происходит активный метаболизм фосфоинозитола и локально формируется фосфоинозитол-3-фосфат [4]. Действие агонистов, требующих активации GaI белков, показывает значительную потерю агрегации и секреции, которые восстанавливаются при одновременной стимуляции Ga2-сопряженным агонистом эпинефрином. При потере ХС в тромбоцитах, GaI преимущественно локализуются в липидных рафтах, которые необходимы для АДФ-зависимой активации тромбоцитов [33].
В активированных тромбоцитах комплекс GpIb/GpIX/ GpV способствует привлечению в рафты фактора XI. Для оптимального связывания фактора XI с мембраной и рафтами необходим протромбин и Са2+ или кининоген и Zn2+. Фактор XI встраивается в мембрану за счет Apple-3 домена, который также определяет его диссоциацию из мембраны. Потеря ХС полностью препятствует связыванию фактора XI с рафтами и снижает скорость активации тромбина на 85% [2].
Молекула гликосфинголипида (GSL) состоит из гидрофобного остатка церамида, который как якорь удерживает молекулу GSL в мембране, и гидрофильного остатка олигосахарида, направленного в сторону от органеллы к цитозолю [21]. Существуют разные способы синтеза GSL:
1) синтез de novo, когда остаток олигосахарида присоединяется к Cer, содержащему сфинганин (дигидросфингозин), который дает 50–90% комплексных сфинголипидов. Предшественниками в биосинтезе GSL являются глюкозилцерамиды (GlcCer), в том числе GlcCer-2, GlcCer-3. Ингибитор sGlcCer снижает синтез ганглиозидов на 90%, а гликосфинголипидов – на 65% [1].
2) гидролиз комплексных сфинголипидов, когда к высвобождаемому Cer присоединяется другой остаток сахара. Обнаружена закономерность, связанная со скоростью метаболизма сфинголипидов и скоростью деления клетки: для быстро делящихся клеток необходим синтез de novo; однако, если необходимость в синтезе GSL низкая (например, в тромбоцитах), GSL синтезируются преимущественно из предшественников, то есть подвергающихся гидролизу комплексных сфинголипидов [12].
3) синтез GSL в эндосомных путях. В лизосомах сапозины катализируют биодеградацию GSL кислыми гидролазами. Для тромбоцитов этот этап метаболизма имеет значение, так как синтез GSL в тромбоцитах может проходить в эндосомах и ранних лизосомах из предшествующих комплексных GSL [21].
Образование Лизо-GSL из GSL катализируется церамид-N-деацетилазой, расщепляющей N-ацильную связь между жирной кислотой и сфингоидным основанием в GSL.
Сфингозинфосфорилхолин (SPC) – медиатор воспаления при вазоспазме и субарахноидальных кровотечениях, он регулирует ангиогенный ответ в центральной нервной системе. SPC активирует р38 МАРК, фактор транскрипции NF-kB, ССААТ-энхансер-связывающий белок. SPC повышает выход МСР-1 (моноцитарного хемоаттрактантного белка-1), который регулирует процессы воспаления в сосудах мозга [41]. SPC индуцирует дифференцировку клеток эндотелия капилляров человека. Гидролиз SPC приводит к образованию Sph и Sph-1-P, который при распознавании его рецептора Edg-1 индуцирует хемотаксис, миграцию и морфогенез клеток эндотелия; этот эффект сравним с действием VEGF (VascularEndothelial Growth Factor) [5].
При атеросклерозе в интиме аорты человека изменяются уровень GSL и активность гликосфинголипид-гликозилтрансферазы. В атеросклеротической бляшке уровень GlcCer mг/мг ХС в 28 раз выше, и 7 раз выше в mг/мг общих фосфолипидов по сравнению с нормальной интимой аорты, при этом уровень лактозилцерамида (LacCer) повышен, соответственно, в 5 и в 4 раза. LacCer из атеросклеротических бляшек повышает скорость пролиферации гладкомышечных клеток сосудов в ~3 раза по сравнению с LacCer из интимы нормальных сосудов, что определяется повышенной долей жирных кислот С16:0, С22:1 и С24:0 в молекуле LacCer при атеросклерозе [8].
Нейтральные GSL мембраны тромбоцитов, обладающие активностью антигенов групп крови, принимают участие в развитии аутоиммунной тромбоцитопении [10].
Ганглиозиды – гликосфинголипиды, содержащие сиаловую кислоту. В покоящихся тромбоцитах основным ганглиозидом является GM3, из которого при активации тромбоцитов образуется ганглиозид GD3. Транзиторное появление GD3 в рафтах плазматической мембраны тромбоцитов обусловливает его ассоциацию с тирозинкиназами Src, Lyn, связывание с Fcg рецептором и последующее повышение экспрессии рецептора CD32 [24]. Ганглиозид GD3 тромбоцитов содержит a2-8-сцепленную сиаловую кислоту, которая распознает белки PbIА и PbIB, кодируемые бактериофагами и экспрессируемые на поверхности S.mitis линии F100 [28]. GD3 снижает уровень глютатиона в митохондриях тромбоцитов и вызывает митохондриальные нарушения, то есть работает как фактор апоптоза. Ганглиозид Gb3 распознает Шига-подобный токсин 3tx1, продуцируемый E.coli. Экспрессия Gb3 регулирует взаимодействие тромбоцитов с лейкоцитами в плазме крови [42].
Ганглиозиды в 2,5 раза повышают адгезию тромбоцитов к коллагену при усилении скорости кровотока. Предварительная обработка ганглиозидами повышает ассоциацию тромбоцитов с клетками нейробластомы и их прикрепление к эндотелию [19]. Экстраклеточные ганглиозиды обладают эффектом ростовых факторов, так как могут распознавать их рецепторы (в том числе FGF (Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like Growth Factor), PDGF) и регулировать сигнальные пути [22].
На тромбоцитах человека обнаружены 5 ганглиозидов с активностью группы крови А, которые выступают в роли аллоантигенов и аутоантигенов к природным изогемагглютининам; их сиалил-А связи чувствительны к действию эндогликоцерамидазы и нейраминидазы. В дополнение к сиалил-iI и сиалил-Le(x)ганглиозидам, тромбоциты с активностью группы крови А могут одновременно экспрессировать ганглиозиды с LKE активностью, в частности, сиалилгалактозилглобозид [10].
В мегакариоцитах, стимулированных форболовым эфиром, мембранная сиалидаза Neu3 способствует деградации сиаловой кислоты плазматической мембраны, что ингибирует сигнальный путь PKC/ERK/p38MAPK, снижает экспрессию рецепторов CD41b и ингибирует дифференцировку мегакариоцитов [20].
Сульфатиды – сульфатированные гликосфинголипиды – локализуются в виде крупных кластеров в центре поверхности тромбоцита, распознают молекулы адгезии (Р-селектин, ламинин, тромбоспондин, фактора фон Виллибрандта) и регулирует адгезию клеток крови и факторов свертывания.
Сульфатиды – природные лиганды Р-селектина; определяющие адгезию и формирование стабильных агрегатов тромбоцитов [25]. Сульфатиды повышают экспрессию Р-селектина на тромбоцитах, повышают активацию рецептора GPIIb/IIIR (PAC-1эпитоп) и усиливают его сигнал; предварительная активация тромбоцитов необходима для того, чтобы сульфатиды повысили агрегацию тромбина с тромбоцитами в плазме. За счет распознавания Р-селектина сульфатиды усиливают агрегацию тромбоцитов с лейкоцитами.
Сульфатиды активируют сигнальный путь Mac-1 (CD11b/CD18), что наблюдается при истончении неоинтимы поврежденных сосудов, при рестенозе после стентирования, а также при воспалении [27]. Повышение уровня сульфатидов в плазме крови коррелирует с повышением экспрессии Р-селектина на тромбоцитах и повышении экспрессии рецептора Мас-1 на нейтрофилах, последнее может быть не только за счет повышения экспрессии L- и Р-селектинов, но и под действием агониста рецепторов [18, 34].
В эксперименте мышам после фотохимического повреждения сосудов вводили сульфатиды [1–10 мг/кг массы в день], что усиливало адгезию нейтрофилов к месту повреждения, и через 21 день обусловливало увеличение объема неоинтимы сосудов. Механизмом является стимуляция сульфатидами уровня свободного Са2+ в цитозоле нейтрофилов, накопление нейтрофилов в субэндотелиальном матриксе и их адгезия с тромбоцитами [34].
Са2+-зависимый белок аннексинV связывает фосфатидилсерин на активированных тромбоцитах и клетках эндотелия и активирует фактор X и протромбин. АннексинV также связывает сульфатиды в присутствии ионов Са2+ и регулирует скорость коагуляции. [17]. На поверхности тромбоцитов сульфатиды взаимодействуют с коагулянтами, участвуют в активации фактора XII, ингибируют адгезию фактора фон Виллибрандта (FvW) к тромбоцитам в циркулирующей крови при стрессе [6]. Связывание FvW с сульфатидами происходит в А1 домене с участием Arg1392, Arg1395, Arg1399и Lys1423 в сайте, который также распознает рецептор тромбоцитов GPIb[30]. Белок плазмы крови b2GPIсвязывает анионные фосфолипиды, а также формирует комплекс с сульфатидами в зависимости от концентрации [26].
Один их негативных регуляторов агрегации тромбоцитов – Dab2 (Disabled-2), появляется на поверхности при активации тромбоцитов, имеет фосфотирозин-связывающий домен (РТВ), конкурирующий с фибриногеном за aIIbb3 рецептор. N-концевой домен белка Dab2, включающий РТВ, специфически взаимодействует с сульфатидами. Это связывание обусловлено двумя консервативными последовательностями, между которыми происходит разрыв при активации клеток тромбином. В тромбоцитах человека обнаружены два пула Dab2 – один связывает сульфатиды, другой – рецепторы интегринов.
Баланс двух изоформ Dab2 контролирует продолжительность ретракции сгустка. Сульфатиды на поверхности тромбоцитов при активации рекрутируют N-PTB на поверхность тромбоцита, отделяют его от интегринового рецептора, что приводит к интернализации N-PTB актин-зависимым путем. Таким образом, Dab2 ингибирует агрегацию тромбоцитов за счет конкуренции с фибриногеном за связывание с рецепторами интегринов aIIbb3. Это взаимодействие модулируется сульфатидами на внешней стороне плазматической мембраны. Регуляторная роль Dab2 N-PNB также распространяется на адгезию тромбоцитов к лейкоцитам и агрегацию [40].
Регуляция активности тромбоцитов комплексными сфинголипидами не ограничивается только представленными данными. Сфинголипиды выполняют также функцию вторичных мессенджеров, предающих информацию по сигнальным путям внутри клетки, регулируют процессы пролиферации, воспаления, апоптоза, миграции, адгезии, а также внутриклеточного движения. Интерес к сфинголипидам обусловлен также тем фактом, что в настоящее время имеется ряд модуляторов, то есть активаторов и ингибиторов метаболизма сфинголипидов, что позволяет регулировать процессы физиологии тромбоцитов.*
Отправить рукопись