СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

Аннотация

Была изучена частота совпадения результатов определения тестов на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза на плотных и жидких средах у 243 культур МБТ. Проведенные исследования показали, что тесты на лекарственную чувствительность на плотной среде не отличаются от данных устойчивости МБТ, полученных на жидких средах при сопоставимых результатах частоты получения положительных посевов. Процент совпадения ТЛЧ на жидкой и твердой питательных средах  составляет для изониазида и рифампицина 100%, а для стрептомицина и этамбутола 98,7% и 96,2% соответственно.

Ключевые слова: микобактерии туберкулеза, лекарственная чувствительность, среда Левенштейна-Йенсена, жидкая среда, выявляемость.

1. Введение

Последние достижения иммуногенетики позволили микробиологам взять на вооружение новые методы выявления патогенных возбудителей, позволяющие значительно сократить сроки выделения, как чистой культуры микобактерий туберкулеза, так и определения их лекарственной устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам (изониазиду, рифампицину, пиразинамиду, этамбутолу и стрептомицину).

В работах многих авторов (Е.Г.Бочкарева с соавторами (2002), В.И. Голышевской с совторами (1996; 2003), О.А. Иртугановой, Н.С. Смирновой (2002), K.A. Angeby с соавторами (2002) , P. Bemer с соавторами (2001)) было показано, что классические методы выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной устойчивости во многом перестают удовлетворять запросы практического здравоохранения, прежде всего из-за длительности их определения (в течении 1-3 месяцев). В последние годы эта проблема стала еще более значимой из-за появления и широкого распространения лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза, требующей быстрого принятия решений при выборе адекватного лечения больного. В то же время традиционные методы определения лекарственной чувствительности МБТ на плотных средах, такие как метод абсолютных концентраций или метод пропорций, связаны со значительными затратами времени, поскольку для их выполнения необходимо 3-4 недели. Такие длительные сроки получения результатов бактериологических анализов задерживают постановку диагноза и назначения адекватной терапии, что осложняет состояние больного и является существенной проблемой не только медицинского персонала, но и общества в целом.

В настоящее время серьезную альтернативу классическим методам выявления МБТ и определения чувствительности на плотных средах представляет автоматизированный бульонный метод BAСTEС MGIT 960 AST. Определение микобактерий туберкулеза и их лекарственной устойчивости с его помощью представляет собой автоматизированный вариант метода пропорций и позволяет значительно сократить сроки исследований (до 21 дня). Согласно этой методике размножающаяся микробная популяция активно поглощает кислород, высвобождая флюоресцентный компонент, который начинает светиться в ультрафиолетовом излучении. Эта новая технология позволяет проводить постоянный мониторинг уровня флюоресценции, который зависит от выраженности бактериального роста. Результаты роста культуры и определения чувствительности учитываются автоматически и выдаются в распечатке.

Между тем, из-за незначительных сроков использования данных методов в практическом здравоохранении, лишь в отдельных исследованиях проводился мониторинг совпадения результатов использования классических и автоматизированных методов определения лекарственной устойчивости МБТ. Так, в работе В.И. Голышевской с соавторами (2003) приводятся результаты сопоставления результатов метода абсолютных концентраций и автоматизированного метода. Согласно полученным данным, совпадение результатов для различных препаратов может быть неодинаковым. Так, для этамбутола совпадение может составлять 95,5%, для рифампицина – до 100%, а для стрептомицина – 98,0%. Однако, сложность и высокая стоимость этих исследований не позволяет на сегодняшний день говорить о решении всех существующих проблем, что и явилось основанием для проведения данного исследования.

Цельисследования состояла визучении чувствительности методов определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам первого ряда на жидких и плотных питательных средах.

2. Материалы и методы

В ходе проведения исследования было обследовано 428 больных туберкулезом легких, находившихся на стационарном лечении в НЦПТ в 2009-2010 гг. Диагноз у всех больных был подтвержден с помощью бактериологических методов исследования. Среди обследованных число впервые выявленных больных составило 248 (57,9%), тогда как больных с рецидивами было 112 (26,2%), а с хроническими формами заболевания – 68 (15,9%). Основные клинико-эпидемиологические данные (возраст, пол, место жительства) устанавливались на основании данных историй болезни пациентов.

Образцы мокроты обрабатывали согласно рекомендациям для посева на жидкие питательные среды. Мокроту деконтаминировали с помощью NALC-NaOH, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин., после чего супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 1-1,5 мл фосфатного буфера. Полученную взвесь использовали для приготовления мазка с окрашиванием по Цилю-Нильсену, посева на жидкие питательные смеси и среду Левенштейна-Йенсена. Бактериоскопию и учет ее результатов проводили согласно рекомендациям ВОЗ и Руководству по контролю над туберкулезом в РК (2008 г). Культуры МБТ выращивали на жидких средах в системе BACTEC MGIT  960 с определением ТЛЧ к препаратам 1 ряда согласно рекомендациям производителей. Лекарственную устойчивость МБТ к препаратам 1 ряда на твердой питательной среде определяли методом пропорций.

3. Результаты

Был проведен анализ результатов бактериологического исследования мокроты 428 больных, которым МБТ в мокроте определяли несколькими методами: бактериоскопически, методом посева на среду Левенштейна-Йенсена и на BACTEC MGIT 960. Их результаты по бактериоскопическому исследованию мокроты и данные посевов на твердые и жидкие питательные среды с определением устойчивости МБТ к препаратам 1 ряда включались в научный и статистический анализ по определению частоты совпадения результатов. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительный анализ выявляемости МБТ на различных питательных средах

Число обсл. больн.	Среда Левенштейна-Йенсена(плотная)	Средн. срок роста МБТ(дни)	BACTEC MGIT 960(жидкая среда)	Средн. срок роста МБТ (дни)	Р
из них МБТ+	из них МБТ+
абс.	%	абс.	%
428	243	56,8	26,4±5,8	298	69,6	8,7±1,9	p<0,05

Статистическая обработка данных показала, что по частоте получения положительных результатов посевов между двумя исследованными методами была обнаружена достоверная статистическая разница (p<0,05). Помимо этого была получена высоко достоверная разница и в сроках детекции МБТ на плотной среде Левенштейна — Йенсена (средний срок детекции составил 26,4±5,8 дней) и на жидкой среде (средний срок детекции составил всего 8,7±1,9 дней) (p<0,001). То есть, выявляемость микобактерий на жидкой среде была в 1,5 раза выше, чем на плотной среде, при этом отмечалось достоверное сокращение сроков исследований (в среднем в 2,5 раза).

На следующем этапе нашей работы мы изучили частоту совпадения результатов определения ТЛЧ на плотных и жидких средах, результаты которых представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты постановки теста на лекарственную чувствительность к препаратам первого ряда на жидких и плотных питательных средах 

Препараты	Жидкая среда	Плотная среда(Левенштей-Йенсена)	%совпадения	Р
кол-во иссл. культур	устойчивость	кол-во иссл. культур	устойчивость
абс.	%		абс.	%
Стрептомицин	243	239	98,3 %	243	236	97,1%	98,7	>0,05
Изониазид	243	89	36,6%	243	89	36,6%	100,0	>0,05
Этамбутол	243	79	32,5%	243	76	31,3%	96,2	>0,05
Рифампицин	243	106	43,6%	243	106	43,6%	100,0	>0,05

Согласно данным таблицы 2, самый низкий процент устойчивости из исследуемых препаратов первого ряда определялся у этамбутола: на жидкой среде устойчивость была выявлена в 79 исследованиях (32,5%), а на плотной среде — в 76 (31,3%). По остальным препаратам результаты устойчивости были одинаково высокие как на плотных, так и на жидких средах. При этом процент совпадений устойчивости на разных средах колебался от 96,7% до 98,7%. Так, для этамбутола совпадение результатов ТЛЧ составляло 96,2%, для стрептомицина – 98,7%, а для изониазида и рифампицина – по 100%. При статистической обработке в сравниваемых методах существенной разницы выявлено не было (p>0,05), что дало основание считать полученные результаты определения лекарственной устойчивости к препаратам первого ряда на плотных и жидких питательных средах сопоставимыми.

Таким образом, полученные данные показали, что тесты на лекарственную чувствительность на плотной среде не отличаются от данных устойчивости МБТ, полученных на жидких средах при сопоставимых результатах частоты получения положительных посевов. Процент совпадения ТЛЧ на жидкой и твердой питательных средах составляет для изониазида и рифампицина 100%, а для стрептомицина и этамбутола 98,7% и 96,2% соответственно.

4. Выводы

При определении лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к препаратам первого ряда на жидких и плотных средах не было выявлено достоверной разницы (p>0,05) в сравниваемых результатах.

Литература

1. Агаев Ф.Ф., Алиев К.А., Салимова Н.А. и др. Туберкулез и болезни легких.-2009.-№9, с.32-35
2. Борило В.Н., Кузьмин А.В., Черноусова Л.Н. и др. Ускоренное определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам в системе « BACTEC MGIT 960» и на биочипах «ТБ-БИОЧИП», Туберкулез и болезни легких, 2009,-№11,-с.56-60
3. Балабанова Я.М., Федорин И.М., Маломанова Н.А. и др. Использование автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 в диагностике лекарственной устойчивости к резервным препаратам в г.Самаре, Туберкулез и болезни легких,-2009-,№10,с.63-70
4. Руководство по контролю над туберкулезом в республике Казахстан, Алматы.-2008.-260 с.
5. Турусов А.А., Валиев Р.Ш., Чеснокова Р.В. Сравнительное исследование микроскопии методом Циля-Нильсена, рутинной флюоресцентной микроскопии и флюоресцентной микроскопии с использованием приставки LUMIN диагностике кислотоустойчивых микобактерий, Туберкулез и болезни легких,-2009.-№4,с.4143