+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

Сравнение результатов гематологических исследований, полученных рутинным методом и с использованием автоматизированной системы

Автор: Д.А. Нуракышев, Б.С. Солтанбаева
Место работы: Городская клиническая больница №5, Отделение отоларингологии и челюстно-лицевой хирургии, г. Алматы

Аннотация

Известно, что автоматизированные методы исследования самых разных параметров крови, в том числе гематологических показателей крови, прочно вошли в  повседневную практику  лабораторной диагностики. С внедрением автоматических анализаторов в лабораторную практику, рутинные методы исследования отошли на второй план, а в некоторых случаях  даже  полностью сместились автоматическими анализаторами. Безусловно, этому способствовали преимущества, пришедшие с  автоматизированными системами. Однако практика показывает, что еще рано полностью отказываться от ручных методов исследований. Автоматические анализаторы, наряду  со всеми своими достоинствами, имеют некоторые недостатки. И в некоторых случаях специалистам лабораторий приходится вносить некоторые коррективы в полученные результаты исследований. В статье идет разбор результатов гематологических исследований, полученных ручным способом, а также  на автоматическом гематологическом анализаторе. Относительно результатов исследований, полученных ручным способом, была произведена оценка правильности результатов, полученных на автоматическом анализаторе. Для гематологических исследований забиралась венозная кровь в специальные вакутейнеры у 100 пациентов клиники. Взятую кровь исследовали одновременно автоматическим (гематологический анализатор) и ручным способом. Результаты обоих методов исследования были подвергнуты анализу и сравнению.  Были анализированы следующие параметры крови (абсолютное и процентное содержание): WBC – лейкоциты, дифференциация лейкоцитов на GRA – нейтрофилы, MID – средние клетки (моноциты , эозинофилы и базофилы), LYM – лимфоциты, RBC – эритроциты, MCH – среднее содержание гемоглобина в эритроците, HGB –гемоглобин, PLT –тромбоциты. Лейкоциты, эритроциты, тромбоциты, гемоглобин сравнивались в абсолютном содержании и концентрации. Такие показатели анализатора как дифференциация лейкоцитов на три субпопуляции (GRA, MID, LYM)  сравнивались с ручным способом подсчета лейкоформулы мазка крови на 100 кл.  Тромбоциты ручным способом подсчитывали по методу подсчета по мазку на 1000 эритроцитов. По результатам исследований выявлено: в 95 случаях данные результатов анализа по обоим методам совпадали. Величина корреляции R2 находилась в зоне достоверности. Причем как для проб с выявленными патологиями, так и для проб без каких-либо отклонений. И только в 5 случаях  показатели, полученные по разным методам исследований, не совпали с большой погрешностью. Погрешность связана с техническими особенностями автоматических анализаторов и их возможностями.

Ключевые слова: 3-х дифференциальный гематологический анализатор, ручные методы исследований, лейкоцитарная формула, правильность, точность измерения.

Введение

Исследование гематологических параметров крови является одним из важных диагностических видов исследования, осуществляемых в лаборатории. Без преувеличения будет сказано, что без общего анализа крови не может обойтись ни один лечащий врач. Данное обстоятельство является причиной того, что именно эти гематологические исследования занимают основную часть рабочего времени  в лаборатории. К счастью, в настоящее время инженерами разработаны анализаторы крови автоматизированного способа.  Так, работнику достаточно лишь вставить пробирку с кровью в анализатор, и анализатор сам произведет нужные процессы и подсчет, и выдаст результаты в напечатанном виде. При этом, время, затрачиваемое на анализ, существенно сокращается. Технология автоматического подсчета клеток крови основана, в первую очередь, на кондуктометрическом методе, который является импедансным способом регистрации частиц. Этот метод базируется на подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Если через узкий канал, заполненный электропроводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот момент сопротивление электрическому току в канале слегка возрастает, и, хотя это изменение невелико, современные электронные приборы способны его улавливать. Каждое прохождение клетки через канал сопровождается появлением электрического импульса. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать число электрических импульсов, которые при этом возникают. Для того чтобы через канал одновременно не проходили сразу 2 клетки, пробу определенным образом разводят до такой концентрации, при которой в канале датчика всегда будет не больше одной клетки. Современные анализаторы способны не только подсчитать количество электрических импульсов, а, соответственно, количество клеток крови, но и измерить с помощью дискриминатора амплитуду возникающего сигнала, которая зависит от размеров самой клетки. Так, тромбоциты, небольшие по размеру частицы, при прохождении измерительного канала генерируют электрические импульсы низкой амплитуды, а сравнительно большие клетки – эритроциты – импульсы высокой амплитуды. Автоанализаторы измеряют концентрацию гемоглобина с помощью встроенного гемоглобинометра.

Прекрасные инженерные мысли и разработки. Однако в клинической практике всегда встречаются непредвиденные обстоятельства. Например, встречаются тромбоцитопатии с повышенной способностью  тромбоцитов к агрегации и адгезии.  Такие тромбоциты, уже находясь в пробирке, частями склеиваются, и на выходе мы получаем сниженное количество свободных тромбоцитов. А анализатор, как мы знаем, подсчитывает лишь свободные формы тромбоцитов. С другой стороны, размер склеившихся тромбоцитов становится похожим на размер лейкоцитов и эритроцитов. И  по прохождению такого конгломерата тромбоцитов через апертуру, полученный электрический сигнал будет причислен к общему сигналу эритроцитов или лейкоцитов. Таким образом, мы получим завышенную концентрацию данных форменных элементов крови. Также на состояние тромбоцитов влияют множество других факторов, например, техника взятия крови из вены, пальца.  По причине несоблюдения правил забора крови или допущении некоторых погрешностей процедурной медсестрой, мы получаем ошибки, описанные выше.  Аналогично этой, существует другая проблема, связанная уже с размерами лейкоцитов и их субпопуляциями.  Лизированную (от эритроцитов) кровь анализатор пропускает далее по каналу подсчета лейкоцитов. И здесь те малые разницы в размере между субпопуляциями лейкоцитов, такими как эозинофилы и нейтрофилы, могут быть не обнаружены анализатором.  И аппарат видит эозинофилов как нейтрофилов. В таких случаях очень часто пропускается эозинофилез. Подавляющее большинство используемых гематологических анализаторов являются 3-х дифференциальными. И разделяют субпопуляции лейкоцитов апертурно-импедансным методом на 3 субпопуляции. Также немаловажно учесть то обстоятельство,  что 5-дифференциальные гематологические анализаторы, все еще не доступны для большинства клиник страны.  На размер лейкоцитов, в первую очередь, влияет процесс лизиса эритроцитов.  Как мы говорили раньше, лейкоциты прежде чем будут отправлены  в камеру подсчета, освобождаются от эритроцитов процессом лизиса. При реакции лизиса разрушаются эритроциты и в растворе остаются лишь лейкоциты. Но лизирующий реагент не оставляет нетронутым и лейкоциты. В результате лейкоциты немного, но изменяются в размере. Такое влияние лизирующего реагента на размер лейкоцитов не определяется постоянной константой. Оно зависит от многих факторов. Например, иммунологическое состояние лейкоцитов, разные физико-химические характеристики лизирующих реагентов отдельных производителей, время выдерживания лизиса, количество добавляемого лизирующего реагента и т.д. Из вышесказанного следует понимать, что автоматические анализаторы, в нашем случае 3-х дифференциальный гематологический анализатор, не могут полностью заменять работу врача-лаборанта. И в некоторых случаях потребуется коррекция и перепроверка результатов автоматического анализа специалистами лаборатории вручную.

Материалы и методы

В работе были исследованы образцы крови 100 пациентов, находящихся на амбулаторном лечении в городской клинической больнице №5 г. Алматы. Возраст больных находился между 22 и 55 годами. 40 пациентов были мужчины, 60 – женщины. Образцы крови забирались в специальные вакутейнеры с антикоагулянтом К2-ЭДТА. Для автоматического анализа крови использовался гематологический анализатор MIndray BC-3200. В ручном методе исследования подсчет абсолютного содержания форменных элементов крови производился на камере Горяева. Для подсчета процентного содержания субпопуляции лейкоцитов приготавливались мазки крови. Мазки крови окрашивались по методу Романовского-Гимзе. Подсчет производился на электронном счетчике форменных элементов крови на 100 клеток. Определение концентрации гемоглобина осуществлялось гемоглобинцианидным методом, с использованием фотоэлектроколориметра и тест-набора «гемоглобин Агат».  Исследование проводилось тремя опытными врачами-лаборантами с большим стажем работы, и двумя опытными фельдшерами-лаборантами.

Автоматическое исследование гематологических параметров крови    

Гематологический анализатор MIndray BC-3200 относится к 3-х дифференциальному автоматическому анализатору нового поколения, работающий на кондуктометрическом принципе измерения частиц (форменных элементов крови). Последние, проходя через апертуру камеры подсчета, выдают определенный электрический сигнал. Количество регистрируемых сигналов соответствует количеству форменных элементов крови, вызвавших эти сигналы.  Высота амплитуды сигналов соответствует размеру форменных элементов крови.

Контроль качества работы анализатора был проведен  контрольной кровью с известными показателями параметров крови. Данные результатов, полученные с анализатора, после проведения анализа с контрольной кровью соответствовали действительному содержанию  элементов крови в контрольном материале.

Исследование образцов крови повторялось дважды последовательно. Результаты записывались раздельно – «Исследование 1» и «Исследование 2»,  ФИО пациента. Анализ полностью автоматизирован, оператору нужно лишь вставить вакутейнер в прободержатель анализатора и нажать на кнопку «СТАРТ». Далее анализатор сам отберет требуемое количество крови, разведет в нужном количестве и произведет подсчет и измерение параметров крови.  Результат выдается в виде распечатки на принтере.

Проводился анализ следующих показателей крови: WBC – лейкоциты, дифференциация лейкоцитов на GRA – нейтрофилы, MID – средние клетки (моноциты, эозинофилы и базофилы), LYM – лимфоциты, RBC – эритроциты, MCH – среднее содержание гемоглобина в эритроците, HGB –гемоглобин, PLT –тромбоциты.

Ручной метод исследования гематологических параметров крови   

Форменные элементы крови подсчитывались на камере Горяева, по общепринятой ручной методике подсчета форменных элементов крови.  Лейкоформула  и тромбоциты подсчитывались в мазке крови  под микроскопом, с помощью электронного счетчика. Лейкоциты подсчитывались на 100 клеток, тромбоциты подсчитывались на 1000 клеток. Мазки крови фиксировались с помощью фиксатора Лейшмана и были окрашены по методу Романовского-Гимзе.  Ручной метод использовался как эталонный по отношению автоматическому.

Результаты исследования

По результатам исследований параметров крови на автоматическом анализаторе были получены следующие данные. Абсолютное содержание WBC – лейкоцитов варьировалось в пределах от 3,2 до 18,2 (109/л). Абсолютное содержание RBC – эритроцитов варьировалось в пределах от 3,8 до 5,8 (1012/л). Абсолютное содержание PLT –тромбоцитов варьировалось в пределах от 120 до 405 (109/л). Концентрация HGB – гемоглобина варьировалась в пределах 80-150 г/л. MCH – среднее содержание гемоглобина в эритроците варьировалось в пределах 20-30 pg. Процентное содержание GRA – нейтрофилов варьировалось в пределах 50-83%. Процентное содержание MID – средние клетки варьировалось в пределах 1-12%. Процентное содержание LYM – лимфоцитов варьировалось в пределах 10-55 %.

Двойное повторение каждого анализа в автоматическом методе, показало 97%-е совпадение по обоим результатам. Для статистического и сравнительного анализа было использовано усредненное значение повторных показателей.

По результатам ручного метода исследования, были получены следующие данные. Абсолютное содержание WBC – лейкоцитов варьировалось в пределах от 3,5 до 16,5 (109/л). Абсолютное содержание RBC – эритроцитов варьировалось в пределах от 3,5 до 5,5 (1012/л). Абсолютное содержание PLT–тромбоцитов варьировалось в пределах от 185 до 390 (109/л). Концентрация HGB – гемоглобина варьировалась в пределах 85-145 г/л. ЦП – цветной показатель варьировался в пределах 0,62-0,87. Процентное содержание GRA – нейтрофилов (палочкоядерные  и сегментоядерные клетки включительно) варьировалось в пределах 55-78%. Процентное содержание эозинофилов варьировалось в пределах 0-18%. Процентное содержание LYM – лимфоцитов варьировалось в пределах 13-50%.

У  42  пациентов из 100 в показателях крови выявлены те или иные отклонения от нормы.  У остальных  58  пациентов  показатели параметров крови находились в пределах нормы. Отклонения от нормы у 37 пациентов были общими как для ручного анализа, так и для автоматического анализа с небольшой разницей лишь в количественных показателях.  Обнаруженные отклонения у остальных 5 пациентов, не совпадали в обоих методах исследования ни по значению, ни по параметру крови. Была проведена статистическая обработка данных без последних 5 случаев. Результаты, полученные как ручным, так и автоматическим методом, прекрасно коррелировали друг с другом (рис. 1-3).

Сравнение результатов гематологических исследований, полученных рутинным методом и с использованием автоматизированной системы
Сравнение результатов гематологических исследований, полученных рутинным методом и с использованием автоматизированной системы
Сравнение результатов гематологических исследований, полученных рутинным методом и с использованием автоматизированной системы

Такие же достоверные величины аппроксимации R2, были получены для HGB – гемоглобин (R2 = 0,896), MCH-ЦП (цветной показатель) (R2=0,905).

В других 5 случаях, в полученных данных по обоим методам, имелись большие расхождения.  В таблице 1 приведены данные расхождений результатов.

Сравнение результатов гематологических исследований, полученных рутинным методом и с использованием автоматизированной системы

Из приведенной таблицы видно, что количество тромбоцитов в автоматическом режиме подсчета снижено почти на 50% во всех первых трех случаях. В последних двух случаях, в ручном подсчете сумма эозинофилов, моноцитов, базофилов получается больше по сравнению с MID-средними клетками (эозинофилы, моноциты, базофилы)  автоматического исследования. И, наоборот, процентное содержание нейтрофилов  увеличено  в результатах автоматического анализа.

Величина аппроксимации для лимфоцитов, находилась в зоне достоверности R2= 0,842 во всех исследованиях(рис. 4).

Сравнение результатов гематологических исследований, полученных рутинным методом и с использованием автоматизированной системы

Время, затраченное на исследования

Общее время, затраченное на исследования всех образцов крови в ручном режиме, включая этап пробоподготовки, составило 7 часов 30 минут.

Время, ушедшее на анализ тех же образцов на автоматическом анализаторе, включая время на подготовку пробы, составило 2 часа.

Выводы и обсуждение

Автоматический анализатор крови большой подарок, подаренный работникам лабораторной диагностической службы. Время проведения анализа сокращается в разы, что невероятно облегчает работу работникам лаборатории. Кроме того, исключаются многие ошибки так называемого «человеческого фактора». Человеческое вмешательство минимизируется до простого вставления анализируемой пробы в прободержатель. Ошибки, допускаемые исследователями при проведении анализа вручную, бывают следующие:

1)     загрязнение пробы или реактивов вследствие неправильного соблюдения работником условий проведения реакции;

2)     неверное положение порядкового номера пробы в штативе (планшете, карусели);

3)     неправильное добавление реактивов к пробе;

4)     неправильное фиксирование времени начала и конца реакции  и др.

Внутренние системы автоматических анализаторов сами промываются и чистятся специальными промывающими растворами, которые присоединены к анализаторам через проводящие трубки.  Такие функции самоочистки в закрытой системе помогают работникам лаборатории облегчить соблюдение санитарно-эпидемиологических правил.

Благодаря перечисленным преимуществам,  автоматические анализаторы по праву заняли почетное место в лаборатории. Благодаря анализаторам, качество выполняемых исследований в лаборатории значительно возросло. Но есть некоторые нюансы в технических особенностях и возможностях автоматической системы, которые нужно знать при проведении анализа, и в некоторых случаях подкорректировать результаты ручным методом. Таким образом, оба метода не мешают, но дополняют друг друга. При таком подходе к исследованию, качество анализов возрастает еще больше.

По результатам наших исследований становится очевидным, что использование автоматических анализаторов в работе лаборатории должно стать золотым стандартом для всех современных лабораторий. Трудозатраты и время на проведение анализа существенно сокращается, и при этом качество и достоверность анализов остается на высоком уровне, что видно из наших исследований. Величина аппроксимации достоверности R2 для всех параметров крови остается на уровне достоверности: для лейкоцитов R2=0,971, для эритроцитов R2=0,957, для тромбоцитов R2=0,953, для гемоглобина R2=0,896, для  MCH-ЦП (цветной показатель) R2=0,905, для лимфоцитов R2=0,842. Но, в то же время, попадаются пробы крови, выходящие за пределы возможностей анализаторов интерпретировать результаты надлежащим образом. В таких случаях необходимо перепроверять результаты анализов ручным способом. В наших исследованиях несовпадений по результатам ручного и автоматического анализа было  5.  Три из них пришлись на тромбоциты, два – на процентное содержание MID – средних клеток, куда объедены эозинофилы, моноциты и базофилы. В первых трех случаях анализатор выдал сниженное количество тромбоцитов. Однако при подсчете тромбоцитов под микроскопом  вручную, количество тромбоцитов оказалось почти вдвое больше. Была обнаружена удивительная особенность тромбоцитов скапливаться в определенных местах на мазках крови. Возможно, функциональное состояние тромбоцитов в данных образцах было изменено, и это послужило причиной недостоверных результатов, полученных анализатором. Но данное предположение и вероятная причина требуют дальнейшего изучения.  В случаях с субпопуляциями лейкоцитов путаницы при дифференциации произошли именно по гранулоцитарному ряду. Так, в пробе №9  суммарное процентное содержание эозинофилов, моноцитов и базофилов было 26% в ручном методе, а автоматическом методе  всего 12% (MID). В пробе №28 суммарное процентное содержание эозинофилов, моноцитов и базофилов, полученных при ручном подсчете, было 19%, тогда как анализатор выдал всего 8% (MID). Была выявлена обратная пропорциональная зависимость по содержанию нейтрофилов. В обоих случаях в анализаторе процентное содержание нейтрофилов было больше по сравнению с ручным подсчетом.  Мы предполагаем, что часть эозинофилов была подсчитана анализатором как нейтрофилы. В результате чего количество нейтрофилов было завышено, а количество эозинофилов занижено. В обоих случаях анализатор не смог обнаружить патологическое повышение количества эозинофилов. А в пробе №9, за счет прибавления эозинофилов к нейтрофилам, общее процентное содержание нейтрофилов вышло за пределы нормы (75%).  Подобные обстоятельства могут ввести в заблуждение лечащего врача о состоянии здоровья пациента. И может быть выбрана неправильная тактика лечения. Во избежание подобных ошибок, рекомендуется перепроверять пробы с подозрительными результатами автоматического анализа, ручным методом. 

Литература:

1)     Люис С.М., Рован М. Оценка необходимости в исследовании мазка крови с подсчетом форменных элементов крови при помощи апертурных и импедансных систем. В: Стандартная гематологическая практика. 1991. Издательство Blackwell Scientific Publication, Великобритания, Оксфорд. ОсниМед; с. 34-42.  

2)     Гриншпун Л.Д. Эозинофилы и эозинофилии (научный обзор). М., 1982. 65 с.

3)     Гриншпун Л.Д., Виноградова Ю.Е. Эозинофилы и гиперэозинофилы // Терапевт. арх. 1983. N 10; с. 147-153.

4)     Абдулкадыров К.М., ред. Гематология. Новейший справочникУчебное пособие. М. ЭКСМО, 2004, 854 с.

5)     Киричук В.Ф. Физиология кровиУчебное пособие. Саратов, Саратовский государственный медицинский университет. 1999, 69 с.

6)     Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследованийУчебное пособие. М., Медицина, 2002, 544 с.

7)     Шиманец О.В., Кохнович Н.Н.  Автоматическая цифровая микроскопия при анализе клеток периферической крови у гематологических больных. Журнал «Лабораторная медицина» 3(6),  2013, Казахстан.