+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Автор: Перевод с английского и редакция Иванова А.В.

Введение

Строение и функции тромбоцитов

Тромбоциты представляют собой безъядерные клетки диаметром от 2 до 4 микрон (рис. 1). Тромбоциты обладают собственной метаболической активностью и способны так же как и другие ядерные клетки отвечать на раздражение. Морфология этих клеток является сложной, они – часть плазматической мембраны с гликокаликсом из множественных мембранных гликопротеинов, преимущественно рецепторов интегринов (фибриногена, фактора фон Виллебранда, коллагена и др.), и рецепторов растворимых агонистов (АДФ, адреналина, тромбоксана A2 и т. д.). На этом уровне поверхность обмена между внешними и внутренними областями клетки увеличивается за счет инвагинации клеточной мембраны. Цитоплазматические части, микроканальцы и микрофиламенты составляют клеточный скелет, который включает в свою внутреннюю структуру многочисленные гранулы, разделяемые на три группы: α-гранулы, плотные гранулы и λ-гранулы. α-гранулы в больших концентрациях содержат важные белки для коагуляции и несколько факторов роста. Недавний протеомный анализ этих гранул продемонстрировал, что α-гранулы содержат более 100 различных белков. Плотные гранулы содержат химические медиаторы, которые необходимы для усиления отклика тромбоцитов при воздействии таких агонистов как АДФ, АТФ, серотонин и адреналин. λ-гранулы представляют собой лизосомы и отвечают за производство супероксидных радикалов и перенос кальция.

В тромбоцитах находятся митохондрии и аппарат Гольджи. Физиологическая роль тромбоцитов заключается в самостоятельном активировании после повреждения сосудов и создании первичного гемостатического барьера для остановки сосудистого кровотечения. Так после разрыва эндотелия, тромбоциты быстро присоединяются к обнаженным коллагеновым волокнам. Затем при участии фактора фон Виллебранда, самоактивируются и выделяют химические медиаторы, АДФ (содержится в плотных гранулах) и тромбоксан (производится посредством активации фермента циклооксигеназы-1 (ЦОГ-1)).Что, в свою очередь, активирует другие тромбоциты в области повреждения и приводит к формированию совокупности тромбоцитов, необходимой для остановки кровотечения. Последовательная каскадная активация  факторов свертывания приводит к образованию и уплотнению сгустков.

Явления, происходящие после повреждения сосудов, очень похожи на патологический результат подобной активации – образование тромба. В сосуде, полость которого сужена из-за наличия атеросклеротических бляшек, в субэндотелиальном слое, по неизвестным на сегодняшний день причинам, происходит фиксирование бляшек и активация тромбоцитов, которые блокируют прохождение эритроцитов через заполненную часть, формируя тромб внутри сосуда, и создавая, таким образом, ишемическое повреждение.

АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ: аналитические принципы и диагностическая значимость

Правильное исследование гемостаза немыслимо без исследования функции тромбоцитов. Для этого должен проводиться обязательный лабораторный анализ, способный определить количественные и качественные изменения тромбоцитов.

Для подсчета тромбоцитов достаточно проведения общего гематологического анализа. При необходимости можно использовать оптический микроскоп.

Также существует ряд методов для определения совокупности функциональных характеристик тромбоцитов. Агрегация тромбоцитов является наиболее универсальным методом анализа, цель которого – оценка «качественных» функциональных характеристик тромбоцитов, т. е. способность тромбоцитов к активации посредством образования агрегатов после активации. Этот метод считается «золотым стандартом» для изучения возможных нарушений функциональных характеристик тромбоцитов как врожденных, так и приобретенных (являются следствием приема антитромбоцитарных препаратов).

Принцип оценки агрегации тромбоцитов по методу Борна является турбидиметрическим: тромбоциты активируют при 37°С одним из добавляемых агонистов. После чего происходит агрегация тромбоцитов, и раствор становится более прозрачным. Экспонометр производит оценку снижения сопротивления при прохождении света за определенный период времени. Коэффициент прохождения обратно пропорционален степени помутнения раствора, что связано со степенью агрегации тромбоцитов. Полученный результат теста отображается графически. В графическом представлении: время после добавления агониста указано на оси ординат (ось x), а степень агрегации тромбоцитов — на оси абсцисс (ось y).

При проведении в лабораторных условиях тестов активации тромбоцитов по методу Борна, необходимо отмечать следующее:

  • Изменение формы. Снижение коэффициента прохождения света, отображаемое на графике, является свидетельством изменения формы тромбоцитов: из дисковидной в сферическую.
  • Первичная агрегация является следствием взаимодействия агониста с соответствующим рецептором.
  • Вторичная агрегация является следствием полной активации тромбоцитов. После первичной агрегации тромбоциты выделяют химические медиаторы, которые продолжают процесс активации тромбоцитов. Биологический смысл вторичной агрегации заключается как в синергическом действии при более низких концентрациях агониста, так и в обособленном действии при более высоких концентрациях агониста.

Универсальность метода заключается в том, что в этом тесте различные агонисты тромбоцитов способны вызывать агрегацию, что позволяет проводить оценку различных шагов активации тромбоцитов. Данные исследования принято проводить с помощью агрегометра при непрерывном перемешивании суспензии тромбоцитов. Все исследования проводят при постоянной температуре в 37°С, следовательно, при физиологической температуре тромбоцитов.

Показаниями для проведения теста агрегации тромбоцитов являются врожденный и приобретенный дефицит совокупных функциональных характеристик тромбоцитов. Последние рекомендации, изданные Британским обществом гематологов, предлагают проведение теста агрегации тромбоцитов для пациентов, страдающих резко выраженным острым геморрагическим синдромом, с нормальными параметрами свертываемости крови и нормальным уровнем количества тромбоцитов. Если тест на агрегацию тромбоцитов осуществляется в специализированных лабораториях, он может обнаружить нарушения, влияющие на состояние пациента (Болтон-Мэггс и др. Обзор наследуемых нарушений тромбоцитов и принципы их лечения согласно UKHCDO. Британский журнал «Гематология», 135, с. 603-633).

За последние годы появляется все больше и больше работ, подчеркивающих заинтересованность в области агрегации тромбоцитов, что особенно важно для оценки биологической эффективности препаратов препятствующих агрегации тромбоцитов (антиагрегантов): ингибиторов синтеза тромбоксана и антагонистов рецепторов АДФ и фибриногена.

ПРАВИЛА ВЫПОЛНЕНИЯ ТЕСТА

В лабораторных условиях агрегация тромбоцитов зависит от многих факторов, которые могут повлиять на результат, а иногда могут создавать путаницу и приводить к ошибкам. В связи с этим, мы должны подчеркнуть то, что метод плохо стандартизирован между разными лабораториями. Методические рекомендации отсутствуют, а также отсутствует внешний и внутренний контроль качества. Для того чтобы выполнить тест агрегации тромбоцитов в соответствии с протоколом исследования многие лаборатории проводят стандартизацию методов и процедур, необходимых для обеспечения качества выполняемого теста. Кроме того, очень важно проводить письменный отчет обо всех предварительных и расчетных параметрах, влияющих на отклик тромбоцитов (Уивиот и др. Агрегация тромбоцитов при применении прасугреля по сравнению с высокими дозами клопидогреля у пациентов с запланированной перкутанной коронарной интервенцией: в Сравнение прасугрель с клопидогрелем в ингибировании активации и агрегации тромбоцитов. Тромболизис при инфаркте миокарда. Исследование 44. Циркуляция. 2007; 116:2923-2932).

Таким образом, основной целью данной публикации является обеспечение необходимой компетенции для подготовки проб, выполнения теста и интерпретации результатов.

Информация для пациентов до начала выполнения тестов

Взятие крови для анализа производится натощак. За неделю до проведения теста не принимайте лекарственные препараты, относящиеся к группе нестероидных противовоспалительных средств, а также другие, в частности, антитромбоцитарные лекарственные препараты. Самый большой риск снижения отклика тромбоцитов – результат действия лекарственных препаратов, принимаемых несистематически, в первую очередь стероидных и нестероидных противовоспалительных средств. В таблице №5 приведены препараты, влияющие на совокупность функциональных характеристик тромбоцитов.

Поэтому очень важно перед выполнением (для выявления возможных нарушений функциональных характеристик тромбоцитов) не принимать никаких лекарственных препаратов за неделю до взятия крови (см. таблицу 5).

Взятие крови

Кровь нельзя подвергать взбалтыванию, так как это может способствовать выделению АДФ, вызывая, таким образом, активацию тромбоцитов. Необходимо избегать длительного перетягивания сосудов жгутом, так как слишком тугое наложение жгута вызывает венозный застой с последующим снижением рН, что также является фактором активации тромбоцитов.

Следует избегать длительного поиска вен. В случае забора крови с помощью шприца, необходимо переливать кровь в пробирку только после удаления иглы, чтобы избежать гемолиз эритроцитов, который может повлиять на количество тромбоцитов и активировать свертывание крови. После забора кровь пациента должна быть своевременно смешена с антикоагулянтом. Что касается теста на агрегацию тромбоцитов, в качестве антикоагулянта, может быть использован 3,2% или 3,8% дигидрат цитрата натрия. Вы можете получить отличные результаты по этому тесту, так как тромбоциты сохраняются в очень хороших условиях. Следует использовать соотношение антикоагулянт-кровь 1:10 (по объему).

Следует избегать слишком интенсивного перемешивания, так как оно может вызвать налипание тромбоцитов на стенках пробирки и их последующую активацию.

Транспортировка образцов

Пробирки с образцами крови могут храниться при комнатной температуре менее одного часа. Во время транспортировки очень важно не трясти и не взбалтывать пробирки с образцами, поскольку может начаться гемолиз с последующим изменением активации тромбоцитов.

Подготовка плазмы насыщенной тромбоцитами (ПНТ) и плазмы бедной тромбоцитами (ПБТ)

Образцы крови, взятые в пробирку объемом 10 мл с дигидратом цитрата натрия центрифугируют при 180-200 g (1000-1100 об/мин в центрифуге с радиусом ротора 14,5 см [5,70 дюйма] или при 880-927 об/мин в центрифуге с радиусом ротора 20,7 см [8,15 дюйма]) в течение 15 минут. Преимущество отдается качающемуся ротору, так как подобное центрифугирование позволяет отделить тромбоциты от других компонентов крови. Супернатант, полученный после центрифугирования, будет содержать ПНТ. Для пробирок с объемами больше или меньше 10 мл следует провести стандартизацию параметров центрифугирования.

Важным шагом является обработка образцов в кратчайшие сроки. Необходимо отделить эритроциты от тромбоцитов в течение 1 часа от момента взятия крови и провести анализ в течение 4 часов от момента взятия крови. Соблюдение этих правил снижает диагностические ошибки.

Особенно осторожно и аккуратно надо работать с ПНТ, так как она содержит очень высокую концентрацию тромбоцитов, что способствует их столкновению друг с другом и возникновению активации. Пробирка, содержащая эритроциты и лейкоцитарное кольцо, подлежит дальнейшему центрифугированию в течение 10 минут при 2000 g для получения плазмы бедной тромбоцитами (ПБТ).

В некоторых случаях, когда содержится большое количество тромбоцитов, необходимо проводить подсчет тромбоцитов в плазме, насыщенной эритроцитами и, если нужно (более 500 * 109), необходимо разбавлять ПНТ буферным раствором с физиологическим уровнем рН. Избегайте разбавления ПНТ посредством ПБТ во время центрифугирования, так как в это время плазма содержит множество продуктов лизиса эритроцитов, которые снижают совокупность функциональных характеристик тромбоцитов (Каттанео и др. Исследования агрегации тромбоцитов: аутогенная плазма бедная тромбоцитами ингибирует агрегацию тромбоцитов при добавлении к богатой тромбоцитами плазмы для нормализации количества тромбоцитов. Гематология, —  2007. —  92:694-697).

Произведите калибровку прибора в соответствии с указаниями, приведенными в руководстве пользователя. Для всех без исключения тестов и процедур следует использовать кюветы из стекла или силиконизированного пластика.

АГОНИСТЫ ТРОМБОЦИТОВ

АДФ, адреналин, коллаген и арахидоновая кислота являются наиболее часто используемыми агонистами для исследований агрегации. Пожалуйста, обратите внимание на то, что каждая лаборатория должна провести серию тестов, по крайней мере, на 20 здоровых добровольцах. Для идеального исследования агрегации тромбоцитов необходимо проводить исследования более чем одного агониста, используя различные концентрации для каждого из них. Ниже приведены агонисты и их стандартные кривые.

АДФ

АДФ обычно используется в концентрациях от 0,4 до 10 мкМ. Этот агонист тромбоцитов, вызывает изменение их формы, первичная агрегация тромбоцитов возникает при малых концентрациях (0,4 – 0,8 мкМ); первичная и вторичная агрегация тромбоцитов регистрируется в виде двухфазной кривой (при концентрации до 4 мкМ) и монофазной кривой (при более высоких концентрациях АДФ). На рис. 2, 3, 4 и приведены примеры агрегатограмм, сделанных с помощью агрегометра AggRAM производства компании Хелена Байосайенсез Еуроп (Великобритания).

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

АДРЕНАЛИН (ЭПИНЕФРИН)

Адреналин используется в концентрациях от 0,2 до 15 мкМ. Также как и АДФ, это агонист тромбоцитов, который вызывает как первичную (от 0,2 до 0,5 мкМ), так и вторичную (> 0,5 мкМ) агрегацию. Основное отличие от АДФ заключается в том, что адреналин не вызывает изменений формы тромбоцитов, а также первичная агрегация не является обратимой. Монофазная вторичная агрегация при проведении агрегации  с адреналином наблюдается редко (см. рис. 6, 7 и 8: примеры агрегатограммсделанных с помощью агрегометра AggRAM производства компании Хелена Байосайенсез Еуроп, Великобритания).

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

КОЛЛАГЕН

Коллаген используется в концентрациях от 1 до 5 мкг/мл. Коллаген не вызывает первичной агрегации. После того, как произошли типичные изменения формы тромбоцитов, происходит вторичная необратимая агрегация. При низких концентрациях, вторичная агрегация сильно зависит от секреции АДФ и тромбоксана (см. рис. 9:примерагрегатограммысделанной с помощью агрегометра AggRAM производства компании Хелена Байосайенсез Еуроп, Великобритания).

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

АРАХИДОНОВАЯ КИСЛОТА (АК)

АК используется в концентрациях от 0,5 до 1,3 мМ. Она является агонистом, который вызывает вторичную агрегацию, агрегатограмма с арахидоновой кислотой очень похожа на агрегатограмму с коллагеном. Процент агрегации зависит от уровня секреции тромбоксана и, следовательно, агрегация с арахидоновой кислотой хорошо отражает чувствительность к лечению аспирином (см. рис. 10:примерагрегатограммысделанной с помощью агрегометра AggRAM производства компании Хелена Байосайенсез Еуроп, Великобритания).

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

РИСТОЦЕТИН

Ристоцетин – это антибиотик, который блокирует образование фактора фон Виллебранда и облегчает собственную агрегацию тромбоцитов. Следующим шагом происходит агглютинация, а не агрегация. Агрегацию с ристоцетином необходимо проводить для диагностики заболевания фон Виллебранда и синдрома Бернара-Сулье. Для диагностирования этих патологий необходимо провести ряд исследований с использованием, по крайней мере, четырех различных концентраций ристоцетина, одна из которых должна быть ниже пороговой концентрации, а другие концентрации должны быть достаточными, чтобы определить агглютинацию. Для проведения дифференциальной диагностики болезни Виллебранда используются различные методы, что подробно описано в специализированной литературе.

ПОДГОТОВКА АГОНИСТОВ

Агонисты тромбоцитов (реагенты для проведения агрегации на агрегометре) должны быть приготовлены согласно рекомендациям компании производителя. Важно, чтобы рабочие концентрации готовили без добавления большого количества разных объемов и концентраций агонистов к ПНТ. В связи с этим наиболее целесообразно готовить каждую порцию рабочей концентрации в 10 раз более концентрированной, чем исследуемый раствор и добавлять агонист в соотношении 1/10 (25 мкл агониста + 225 мкл ПНТ). Для сохранения и стабильности исходного раствора, следуйте рекомендациям производителя. Рабочие растворы готовят ежедневно и хранят в прохладном месте, до завершения выполнения всех тестов.


Таблица 1 показывает объемы разведения в зависимости от концентрации исходного раствора, в соответствии с рекомендациями компании Хелена Биосайенсез Еуроп (Великобритания)

АДФ
Исходный раствор: 200 мкМ
Концентрация рабочего р-раИсходный (мкл)Физиологический (мкл)Стабильность рабочего р-ра
2-80C-200C
1 мкМ101907 дней3 месяца
2 мкМ20180
5 мкМ50150
Адреналин
Исходный раствор: 3 мкМ
Концентрация рабочего р-раИсходный (мкл)Физиологический (мкл)Стабильность рабочего р-ра
2-80C-200C
1 мкМ12997 днейне замораживать
10 мкМ7193
15 мкМ10190
Коллаген
Исходный раствор: 100 мг/мл
Концентрация рабочего р-раИсходный (мкл)Физиологический (мкл)Стабильность рабочего р-ра
2-80C-200C
1 мкг/мл201804 неделине замораживать
2 мкг/мл40160
4 мкг/мл80120
Арахидоновая кислота 
5 мг/мл= 15 мкМ
Концентрация рабочего р-раИсходный (мкл)Физиологический (мкл)Стабильность рабочего р-ра
2-80C-200C
0,5 мМ6613424 часане замораживать
0,75 мМ100100
1 мМ13466

Таблица1. Рабочие растворы. При использовании агрегометра AggRAM для всех агонистов проводится одинаковый алгоритм выполнения методики: 25 мкл агониста  + 225 мкл ПНТ.

Параметры агрегации (ответ тромбоцитов на действие агонистов)

Высокая универсальность теста заключается в его способности выделять более чем одну фазу ответа тромбоцитов на воздействие агонистов. Для составления отчетов могут быть использованы различные параметры и показатели, как правило, это:

  • максимальный процент агрегации;
  • процент агрегации в указанное время;
  • процент агрегации по окончании указанного времени;
  • крутизна кривой, представляющая собой прямой участок при максимальном наклоне вторичной кривой;
  • латентный период, который является промежутком времени от момента добавления агониста до момента начала агрегации тромбоцитов;
  • время, необходимое для достижения максимального процента агрегации;
  • порог концентрации для первичной и вторичной агрегации (рис. 11).

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ И ИССЛЕДОВАНИЮ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Рис. 11. Параметры агрегации

В основном для агрегации с АДФ и адреналином (эпинефрином) используются параметры максимального процента агрегации как первой волны, так и второй; для коллагена и арахидоновой кислоты — максимальный процент агрегации и время латентного периода. Недавние исследования, проведенные для оценки терапевтической эффективности тиенопиридинов, подчеркнули обратимость вторичной волны агрегации с агонистом  АДФ (см. рис. 5b, сделанный с помощью агрегометра AggRAM производства компании Хелена Байосайенсез Еуроп, Великобритания) у пациентов, проходящих постоянное лечение этими препаратами. Для того, чтобы избежать добавления дополнительных параметров в отчет анализа (это может привести только к путанице) можно использовать процент агрегации на 4 минуте (рис. ). Этот параметр позволяет исключить ряд ошибок и имеет преимущество благодаря выраженному максимуму первичной агрегации: как правило, не очень просто определить является ли ответ на активатор первичным или вторичным.

Как было сказано ранее, каждая лаборатория должна стандартизировать
параметры проведения тестов агрегации тромбоцитов, по крайней мере, на 20 здоровых добровольцах. Ниже (таблица 2) мы приводим Вам наш лабораторный опыт (Здесь и далее приведены данные полученные Фабио Пульчинелли в Университете «Ла Сапиенца» (Рим, Италия):

АДФ, процент агрегации на 4 минуте, в концентрациях 0,8 и 2 мкМ.

Адреналин, процент агрегации на 4 минуте, в концентрациях 0,5 и10 мкМ.

1 и 2мг/мл коллагена – латентный период и максимальный процент агрегации.

0,75 мМ арахидоновой кислоты — максимальный процент агрегации.

Таблица 2

Агонист и его концентрация% пациентов с показателем агрегации< 20 %Средний показатель агрегацииЛатентный период
0,8 АДФ5577 ± 24
2 АДФ287 ± 19
0,5 Адреналин3676 ± 24
10 Адреналин292 ± 15
1 Коллаген384 ± 2360 ± 24
2 Коллаген095 ± 948 ± 21
0,75 Арахидоновая кислота392 ± 14

Таблица 2 показывает процент пациентов, имеющих процент агрегации на 4 минуте ниже 20%; отклонение количества пациентов (среднее±стандартное), имеющих процент агрегации на 4 минуте выше 20%. Данные процентного соотношения были получены в нашем центре в течение последнего года. Они представляют 190 примеров агрегации и были выполнены с помощью агрегометра AggRAM производства компании Хелена Байосайенсез Еуроп (Великобритания) для пациентов, которые не принимали никаких антитромбоцитарных лекарственных препаратов.

Отклик у пациентов, принимающих препараты, предотвращающие агрегацию тромбоцитов (антиагреганты)

АСПИРИН

Вызывает снижение вторичной волны агрегации при проведении исследований с низкой концентрацией АДФ и адреналина, увеличивает латентный период и снижает максимальный процент скопления коллагена до 4 мкг/мл. Отсутствие ответа при агрегации с арахидоновой кислотой.

Таблица 3

Агонист и концентрация% пациентов с показателем агрегации<20 %Средний показатель агрегацииЛатентный период
0,8 АДФ6945 ± 18
2 АДФ260 ± 20
0,5 Адреналин8148 ± 17
10 Адреналин2058 ± 18
1 Коллаген7448 ± 2573 ± 22
2 Коллаген244 ± 2265 ± 35
0,75 Арахидоновая кислота5027 ± 25

Таблица 3 показывает количество пациентов (в %), имеющих процент агрегации на 4 минуте ниже 20%; отклонение количества пациентов (среднее±стандартное), имеющих процент агрегации на 4 минуте выше 20%. Данные процентного соотношения были получены в нашем центре в течение последнего года. Они представляют 336 агрегатограмм, выполненных с помощью агрегометра AggRAM производства компании Хелена Байосайенсез Еуроп (Великобритания) для пациентов, которые принимали аспирин (75-330 мг/сутки) не менее 30 дней.

ТИЕНОНИПРИДИНЫ

Таблица 4 показывает количество пациентов (в %), имеющих процент агрегации на 4 минуте ниже 20%; отклонение количества пациентов (среднее±стандартное), имеющих процент агрегации на 4 минуте выше 20%. Данные процентного соотношения были получены в нашем центре в течение года с помощью агрегометра AggRAM производства компании Хелена Байосайенсез Еуроп, Великобритания и представлены для 220 пациентов, которые принимали тиклопидин (150-300 мг/сутки) или клопидогрель (75 мг/сутки) не менее 30 дней. Эти лекарственные препараты относятся к классу препаратов-антагонистов рецепторов АДФ, P2Y12. Как правило, при приеме тиенопиридинов происходит снижение вторичной агрегации для АДФ, снижение вторичной агрегации в ответ на малые концентрации коллагена и арахидоновой кислоты.

Таблица 4

Агонист и концентрация% пациентов с показателем скопления < 20 %Средний показатель скопленияЛатентный период
0,8 АДФ9355 ± 25
2 АДФ5559 ± 27
0,5 Адреналин4771 ± 24
10 Адреналин487 ± 18
1 Коллаген1166 ± 2667 ± 30
2 Коллаген182 ± 2155 ± 24
0,75 Арахидоновая кислота1187 ± 19

ПРИЛОЖЕНИЕ


Таблица 5. Лекарственные препараты, снижающие совокупность функциональных характеристик тромбоцитов

Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС):АспиринИбупрофенМефенамовая кислотаИндoметацинИнгибиторы ЦОГ-2Психотропные и анестезирующие средства:Трициклические антидепрессанты (напр. имипрамин)Фенотиазины (напр. хлорпромазин)Местные и общие анестезирующие препараты (напр. галотан)
Противомикробные препараты:ПенициллинЦефалоспоринНитрофурантоинГидроксихлорохинАмфотерицинПротивоопухолевые средства:МитомицинДаунорубицинКармустин
Сердечно-сосудистые вещества:β-адреноблокаторы (напр. пропанол)Сосудорасширяющие средства (напр. нитропруссид, нитроглицерин)Диуретики (напр. фуросемид)Блокаторы кальциевых каналовРазносторонние средства:ДекстранРадиографический контрастХинидинЭтанол

Антикоагулянты:ГепаринКумадинЛепирудинАргатробанБивалирудинПища:КофеинЧеснокТминКуркума
Тромболитические средства:СтрептокиназаУрокиназаТканевой активатор плазминогенаАнтитромбоцитарные препараты:
Ингибиторы фосфодиэстеразы: ДипиридамолЦилостазол
Антагонисты рецепторовАДФ:ТиклопидинКлопидогрель
Антагонисты гликопротеидов IIb/IIIA:АбциксимабЭптифибатидТирофибан 


Взято из журналов:

Архивы Патологии и Лабораторной медицины: том126, № 2, стр.133-146. Лабораторная диагностика расстройств тромбоцитов. Алгоритмический подход. Кадис Коттке-Марчант, ДМ, ДН, Джордж Коркоран, ДМ, для Колледжа американских патологоанатомов Ресурс Комитета Гемостаза

Таблица 6. Предварительная проверка

МетодКонтроль качества (Дополнительная информация выделена курсивом)
Общая информация о пациенте
• Личные данные• Пациент перед взятием крови должен быть натощак 
• Отчет о препаратах, принятых в последние две недели и указание их дозировки
• Патологический анамнез (с более детальной информацией о патологии свертывания крови, сердечно-сосудистых заболеваниях и последних инфекционных заболеваниях)
• Личные данные:
• Пациент перед взятием крови должен быть натощак 
• Препараты, принятых в последние две недели и указание их дозировки
• Патологический анамнез

Информация об образце крови
• Отчет о времени взятия крови
• Взятие крови должно осуществляться без венозного застоя иглой• Кровь д. б. добавлена в пробирку, содержащую 3,8% дигидрата цитрата натрия
• Образцы не должны содержать гемолиз
• Время забора
• Сложности при заборе

Обработка образцов
• Храните образцы при температуре 20-25°C, в течение одного часа с момента забора крови, приготовьте ПНТ
• Подготовить ПНТ путем центрифугирования образца при 180-200 g в течение 10 мин
• Подготовка ПНТ центрифугированием образца при 2000 g в течение 10 минут
• Убедитесь, что концентрация тромбоцитов в ПНТ совпадает с диапазоном прибора
• Если нет, разбавьте ПНТ соответствующим буфером
• Проводите периодический внутренний контроль агрегации. Начните анализ со здоровых добровольцев
• Образец доставлен
• Время подготовки ПНТ
• Время и скорость центрифугирования для подготовки ПНТ и ПБТ
• Укажите, если ПНТ был разбавлен, какой использовался буфер
• Проводилось выполнение внутри лабораторного контроля качества?

Инструменты для диагностики
• Убедитесь, что прибор настроен в соответствии с инструкциями производителя
• Используйте только кюветы из стекла или силиконизированного пластика, проверьте их целостность
• Разведите реагенты в соответствии с инструкциями производителя и храните рабочие растворы в прохладном месте
• Предварительно подогревайте образцы, в соответствии с рекомендациями производителя
• Использованы кюветы
• № партии агониста
• Дата приготовления исходного раствора агониста 
• Обнаружены следующие проблемы