+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

Селекция перевивных опухолей на повышение клоногенной способности и специфической органотропности и применение в радиобиологических исследования

Автор: Б.И. Исмаилов, С.Б. Исмаилов
Место работы: д.м.н., проф. КазНИИ онкологии и радиологии, г. Алматы, к.м.н., руководитель лаб. статистики РГП «Научный центр противоинфекционных препаратов», г. Алматы

Summary

During the long intravenous passing, variants of rhabdomyosarcoma, Walker’s carcinosarcoma in rats with a high affinity to the lung tissues were selected. The specific character of the manifestations of the sign “lung tropism” is shown. Clonogenic cells, selected according to this sign, possess nearly all the features of tumor cells such as heterogeneity of the cell division rate, cell size, mutability, radiosensitivity, etc. All these features and the clonic origin of tumor knots in lungs permits to use affinitive sub-strains in various radiobiological investigations.

Ключевые слова: селекция, перевивные опухоли, клоногенные клетки, клоны, клоногенная способность, органоспецифичность, гетерогенность.

Многие годы в радиобиологических исследованиях находят широкое и эффективное применение методы клонального анализа популяций нормальных и опухолевых клеток в условиях in vitro [1]. Методы же клонального анализа in vivo применяются, в основном, лишь популяциям кроветворных костномозговых клеток мышей [2], так как в условиях in vivo от нормальных клеток другого гистогенеза не удается получить достаточное число потомств отдельных клеток (клонов). Именно поэтому, хотя значимость клонального анализа в условиях in vivo для радиобиологических исследований хорошо понятна радиобиологам, до сих пор радиобиологические исследования, выполненные этим методом на клетках злокачественных опухолей, появляются лишь спорадически [3], а радиобиологические исследования, выполненные методом клонального анализа in vivo на некроветворных нормальных клетках человека и животных полностью отсутствуют.

Вместе с тем, изучение радиобиологии клоногенных опухолевых клеток приобрело к настоящему времени чрезвычайно большой интерес, так как за последние десятилетия стало очевидным, что важнейшие проявления злокачественного роста – инвазивный нерегулируемый рост опухолей, их метастазирование и адаптация к действию противоопухолевых агентов обусловлены особенностями клоногенных, т.е. способных к неограниченной пролиферации клеток, а не всех клеток злокачественных опухолей [4, 5].

В настоящей публикации описывается довольно простая методика, с помощью которой можно селектировать экспериментальные опухоли различного гистогенеза с резко повышенным процентом содержания клоногенных клеток и обсуждаются перспективы использования таких линий в радиобиологических исследованиях.

Материал и методы.         В качестве материала для селекции были взяты перевивные рабдомиосаркомы крыс (РМС) и опухоли карциносаркомы Уокер (КСУ). РМС крыс индуцировались внутримышечным введением 20-метилхолантрена: выросшие опухоли трансплантировались подкожно и выросшие опухоли подвергались клонированию. Для клонирования опухолевая ткань, лишенная некроза, измельчалась ножницами, промывалась раствором Хенкса и обрабатывалась 0,25% раствором трипсина на магнитной мешалке (37оС, 40 мин). Суспензия одиночных опухолевых клеток после фильтрования через 4-х слойный марлевый фильтр осаждалась и ресуспендировалась, просматривалась под микроскопом в камере Горяева, разводилась в среде Игла до нужной концентрации и вводилась в одну из латеральных хвостовых вен [6]. Опухолевые узлы, сформировавшиеся в легких привитых крыс, извлекались и использовались для следующего цикла отбора на аффинитет опухолевых клеток к легким. В опытах с карциносаркомой Уокер использовались солидные опухоли и трипсинизация заменялась измельчением таких опухолей или их клонов с помощью острых ножниц.

Результаты и обсуждение. В первых исследованиях отбора доля клоногенных клеток, способных имплантироваться и активно пролиферировать в легких, составляла всего 10-7, затем она повышалась и через 40-50 циклов отбора достигла величины 10-1. В первых поколениях отбора приходилось прививать по 1-3 млн. клеток на крысу; затем дозы прививаемых клеток были снижены до 100-200 тыс. Когда клоногенная способность клеток РА-2 повысилась, примерно в 1000 раз (10-3 клоногенных клеток в популяции), дозы внутривенно вводимых клеток вновь были понижены до 25-50 тыс. После 45 циклов отбора, реклонирования стали проводить при дозе 1000 жизнеспособных клеток на крысу. При такой дозе в легких формируется от нескольких десятков до100-200 клонов. Низкая клоногенная способность характерна для большинства первичных и перевиваемых опухолей мышей и крыс [7-11].

В результате отбора процент клоногенных клеток в опухолях крыс может быть, по-видимому, повышен сильнее, чем в опухолях мышей. Меланома В16 мышей, отселектированная Фидлером на аффинитет к легким, дает всего 10-20 клонов на 1000 внутривенно введенных клеток [9], из-за того, что клетки крыс обладают более низкими частотами спонтанных хромосомных нарушений, чем клетки мышей [12].

При клонировании и в пределах первых четырех реклонирований, карциносаркома Уокер характеризовалась более низкой эффективностью колониеобразования в легких. Так, при внутривенном введении опухолевых клеток в количестве 0,5×105, 105, 2,5×105, 4×105 и 5×105 на крысу величина КОЕ колебалась от 1 до 7 на 105 клеток. При этом почти у 50% привитых крыс клоны в легких вовсе не развивались, и преобладало число крыс с количеством клонов в легких от 1 до 10. На 5-м реклонировании отмечалось резкое скачкообразное повышение эффективности колониеобразования КСУ в легких, которое выражалось величиной КОЕ – 105 клеток и увеличением количества крыс с числом клонов более чем 100. Средняя КОЕ на 105 клеток по результатам 3-5 реклонирований (У-Х цикл отбора) составляла 110±13,1; 81±11,6 (ХУ-ХХ цикл отбора) и 132±21,2 (ХХУ-ХХХ цикл отбора). В дальнейшем высококлонируемый в легких вариант КСУ (штамм КИО) поддерживался путем трансплантации интактным крысам двумя способами: внутривенно по 105 клеток и подкожно по 0,3 мл опухолевой кашицы, приготовленной на растворе Игла в соотношении 1:1.

Специфика аффинитета к легким. В первых поколениях отбора клетки РА-2 не проявляли специфической тропности к легочной ткани – после внутривенного введения опухолевые узлы (экспериментальные метастазы) формировались не только в легких, но и в лимфоузлах, сердце, печени. После 10 циклов отбора у вскрываемых животных обнаруживались только легочные опухолевые узлы, что свидетельствовало о формировании специфической тропности клоногенных опухолевых клеток к легочной ткани. После 50 циклов отбора были поставлены специальные опыты по изучению тропности клеток РА-2 к легким. Для этого опухоли имплантировали подкожно, в толщу бедренной мышцы и под кожу хвоста. Во всех этих опытах через 16-18 суток, помимо опухолей в месте прививки, были обнаружены макроскопические опухолевые узлы в легких. В других органах опухолевых узлов не было. Таким образом, многие клетки РА-2 способны мигрировать из мест прививки опухоли, достигать легких и активно в них пролиферировать. По данным Фидлера [5], тропность клеток меланомы В16 к легким обусловлена наличием специфических визикул на наружной цитоплазматической мембране, и может быть передана с помощью мембранной фракции неаффинитетным клеткам. Природа тропности к легким клеток РА-2 в настоящее время изучается. Свойство формировать опухолевые узлы (клоны) в легких в большом количестве для субштамма КИО сохранилось стабильно при обычном подкожном способе трансплантации. КОЕ (число колониеобразующих единиц) на 105 внутривенно введенных клеток составляла на 11 и 21 пассажах соответственно 31,2±11,7 и 42,3±7,8. Аналогичные наблюдения отмечены в работе Хасегавы с соавторами [13] на примере карциномы Эрлиха, прошедшей отбор на повышение аффинитета к легочной ткани и сохранившей свойства аффинитетности после 70-кратной подкожной перевивки.

Темпы деления клеток. В первых циклах отбора макроскопические опухолевые узлы обнаруживались в легких привитых животных через 25-30 сут. после внутривенного введения клеток. Через 20-15 циклов отбора подобные узлы весом 25-30 мг начали формироваться на 22-25 сут; после 40 циклов отбора серийное пассирование клеток РА-2 стали проводить через 16-18 сут., так как к этому времени клоны в легких достигают указанного выше веса, после чего, как показали специальные опыты, средние темпы деления клеток в клонах начинают замедляться. Таким образом, в ходе отбора на аффинитет происходит одновременный отбор на повышение средних темпов деления клоногенных опухолевых клеток, обладающих тропностью к легким. Среднее генерационное время (Т) у подобных клеток сократилось  с 32 до 24 ч.

Популяция клоногенных клеток РА-2 остается гетерогенной по темпам деления. Варьирование клонов по их константам экспоненциального роста (КЭР) [14] соответствует варьированию у них Т от 18 до 32 ч. Межклональные различия по темпам деления обусловлены как влиянием факторов среды, так и наследственными различиями клонов. Коэффициент реализованной наследуемости (h2) темпов деления при отборе на замедление скорости пролиферации равнялся 0,35, а при отборе на повышение темпов деления – 0,08. Средний коэффициент наследуемости признака «темп деления клеток» составил 0,12. Аффинитетный субштамм КИО характеризуется более высоким фактором самоускорения (s2) и более коротким временем удвоения (Т) при подкожных трансплантациях. Так, при трансплантации 0,1 млн., 1 млн., 3 млн. и 5 млн. опухолевых клеток, фактор самоускорения (s2) колебался для КСУ в пределах 0,156-0,31 сут-1, для КИО соответственно – 0,22-0,61 сут-1.     

Среднее время удвоения (Т) для КИО равнялось 24,58-74,4 ч, а  для КСУ – 55,2-106,6 ч, в зависимости от дозы клеточного инокулянта. Эти результаты свидетельствуют о том, что процесс отбора клеток на повышение тропности сопровождается одновременно селекцией на более быстрый темп клеточного деления.

Гетерогенность клоновой популяции РА-2 по темпам деления была охарактеризована выше. В потомстве клоногенных клеток РА-2 среднее содержание ДНК в интерфазных ядрах колеблется от 141,6±9,0 до 232,9±20,2 отн. ед., что в пересчете на единицы плоидности дает колебания от 2,8 до 4,6 С. По этому показателю клоновые популяции РА-2 не отличаются от популяций РА-2, растущих подкожно. Размах изменчивости клоновой популяции РА-2 по плоидности типичен для РМС мышей и крыс, не прошедших отбор на аффинитет к легким [15]. В потомствах клоногенных клеток РА-2 геномные мутанты, т.е. варианты с измененным числом хромосом, возникают с частотой (10,8±0,3)×10-2 – (13,7±0,3)×10-2, причем клетки с уменьшенным числом хромосом возникают примерно в 3 раза реже, чем клетки с увеличенным числом хромосом. Очевидно, по этой причине и сохраняется высокая кариотипическая гетерогенность штамма РА-2. Модальный класс образован гиперплоидными клетками. Наблюдаются достоверные межклональные различия по мутабильности, обусловленные, в том числе, различиями клонов по плоидности и темпам деления клеток.

Клоновая популяция РА-2 гетерогенна по размерам клеток. Клоны варьируют по среднему диаметру составляющих их клеток от 12,7±0,4 до 14,17±0,5 мкм, т.е. несколько меньше, чем варьирует средний диаметр клеток в различных участках подкожно растущей опухоли РА-2 (10,8±1,5-15,1±0,2 мкм). По среднему объему клеток клоны РА-2, растущие в легких, варьировались от 1232±21 мкм3 до 1972±208 мкм3, а клетки подкожно растущих опухолей – от 751±28 мкм3 до 2198±84 мкм3. Вариабельность размеров клоногенных клеток РА-2 обусловлена как наследственными, так и средовыми факторами.

Отбор на аффинитет в клеточных популяциях солидных форм перевивных опухолей проводится с помощью периодического чередования культивирования опухоли in vitro и  in vivo [9,10]. Это достигается повышением эффективности отбора на органотропность, но адаптация перевивных опухолей к росту в однослойных культурах представляет собой самостоятельную проблему. Как показывают приведенные выше данные, прямой массовый отбор в условиях in vivo также приводит к получению перевивных штаммов с повышенным аффинитетом к легким. В то же время присущая опухолевым клеткам способность имплантироваться и расти в других органах перестает проявляться и, что наиболее существенно, резко (на 5-6 порядков) повышается процент клоногенных клеток в популяциях. Линейная зависимость между числом клеток и числом формирующихся в легких опухолевых узлов показывает клональное происхождение этих формирующихся узлов, т.е. происхождение каждого узла от одной клоногенной клетки. По-видимому, использованные простые методы отбора на аффинитет могут быть успешно применены к опухолям разного гистогенеза и при селекции на тропность опухолевых клеток к разным органам.

В литературе имеются немногочисленные данные, характеризующие структуру клоновых популяций перевивных опухолей с повышенным аффинитетом  к легким. Проведены цитофотометрические исследования содержания ДНК в клетках разных клонов и описаны некоторые параметры роста клонов [17]. Судя по этим данным, все штаммы с повышенным аффинитетом имеют весьма полиморфные популяции клоногенных клеток. Таким образом, отбор на аффинитет не приводит к заметному снижению гетерогенности, присущей популяциям обычных перевивных опухолей, т.е. не прошедших селекции на специфическую тропность к тому или иному органу. Возможно, различия между аффинитетными и неаффинитетными штаммами по каким-либо признакам существуют, но в настоящее время о них ничего не известно. Единственное различие – это различие по проценту клоногенных клеток, выявляемому в экспериментах по клонированию in vivo. Полиморфизм непрерывно воспроизводится, в том числе из-за описанных выше высоких частот геномных мутаций в потомствах клоногенных клеток. Гетерогенность в потомстве отдельной клетки нарастает очень быстро, и поэтому клональные линии, выделяемые in vivo, не обладают однородностью клеточного состава. Это означает, что линии с повышенным аффинитетом наиболее пригодны для радиобиологических исследований, имеющих целью изучение популяционных аспектов действия радиации на злокачественные опухоли, исследований, объектом которых является не отдельная опухолевая клетка, а полиморфная популяция клоногенных опухолевых клеток. Примером подобного рода исследований является изучение влияния рентгеновского излучения на изменение клональной структуры субштамма КИО по признаку радиочувствительности [16]. Популяционными являются и методы определения наследуемости по признаку «радиочувствительность» клеток КИО [17].

Опыт подобных популяционных исследований накоплен при использовании клонального анализа в условиях in vitro [4,19] и при радиобиологических исследованиях селезеночных колоний костномозговых клеток. Клональный анализ  in vivo позволяет, во-первых, приблизить условия тестирования эффектов радиации к тем, которые характерны для опухолей in situ; во-вторых, изучить действие радиации на клоногенные клетки в условиях организма, а не на клетки, проявляющие свойства клоногенности при культивировании вне организма. Эти преимущества использования аффинитетных линий радиобиологических исследований носят принципиальный характер. Следует учесть и преимущества чисто механические (технические моменты постановки экспериментов см. [3]). Они обусловлены несоизмеримо большим числом клеток в клонах in vivo (до нескольких десятков миллионов) по сравнению с клонами in vitro, возможностью сочетать клонирования с подкожными и внутрибрюшинными трансплантациями и сравнительной легкостью реклонирования отдельных клонов. Как указывалось выше, клоны РА-2 и КИО достигают на 14-18 сут. веса 20-50 мг и более [18]. Макрофото описанных аффинитетных опухолевых субштаммов приведены в публикации. Кусочки ткани, весом от 6 до 20 мг, взятые от таких клонов, можно индивидуально исследовать электрофоретически на содержание изоферментов; полученные от таких кусочков суспензии могут быть изучены методом проточной флуорометрии для анализа средней плоидности клеток в клонах и характера их распределения по фазам митотического цикла [7]; могут быть индивидуально охарактеризованы клоны и по частотам сестринских хроматидных обменов (СХО), и по содержанию ферментов репарации лучевых повреждений [19]. Существенно, что индивидуальное тестирование клонов не является препятствием для размножения клеток клонов путем кожных прививок и реклонирований. Это позволяет выделить мутанты по генам, ответственным за репарации лучевых повреждений без использования селективных сред, применение которых в условиях in vivo для этих целей осуществить не удается. Все сказанное выше свидетельствует, что перевивные  штаммы опухолей с повышенным аффинитетом клеток к легким найдут в ближайшие годы широкое и разнообразное применение в радиобиологических исследованиях, а также в области разработки новых клеточных технологий.

Литература:

1. Puck, T.T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1958, 44, 4, p. 772-780.

2. Till, C.B. Mc Cullech, E.N. Red. Res., 1961, 14, p. 213-322.

3. Hill, R.P., Bush, R.S. Int. J. Radiat. Biol., 1969, 15, 5, p. 435-444.

4. Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г., Готлиб В.Я. Клеточные факторы реакции опухолей на облучение и химиотерапевтические воздействия. М., 1978.

5. Poste, G., Fidler, I.J. Nature, 1980, 283, 10, p. 139-146.

6. Вахтин Ю.Б., Швембергер И.Н.  Цитология и генетика рабдомиосарком.  Л., 1968.

7. Suzuki, H.H., Withera, N.R., Kochier, H.W. Cancer Res., 1978, 38, 10, p. 3349-3351.

8. Вахтин Ю.Б., Степаньян Л.И. Эксперим. Онкология. 1980, 2. 4, с.53-57.

9. Fidler, I.J. In: Methods in cancer research, 1978, 15, p. 399-439.

10. Fidler, I.J., Geraten, D.N., Hart, I.E. In: Advances in center research, 1976, 28, p. 150-236.

11. Fischer, B., Fischer, E.R. In: Methods in Cancer Research, 1987, p. 244-284. 

12. Morrow, J. Mut. Res., 1975, 33, 2, p. 367-372.

13. Hasagava, Y., Iricusa, T., Ishidate, M., Mizumo, D. Cann, 1970, 60, J, p. 73-77.

14. Collins, V.P., Loeffier, R.K., Tivey, H. Amer. J. Rochtgenol., 1956, 76, I, p. 73-78.    

15. Степаньян Л.И., Григорьева Э.Р., Сенчакова Е.В.  Цитология, 1979, 21, 9, с. 1074-1080.

16. Исмаилов Б.И.  Радиочувствительность и клональная структура опухолей. Наст. Сб.

17. Исмаилов Б.И., Вахтин Ю.Б. Определение наследуемости радиочувствительности экспериментальных опухолей in vivo. Методическая рекомендация. Алма-Ата, 1982, 20 с.

18. Исмаилов Б.И., Исмаилов С.Б.  Выявление наследственной гетерогенности популяции стволовых опухолевых клеток при клонировании in vivo. Лаб. Медицина. 2012. 2(3), с. 68-71.19. Жестяников В.Я. Репарация лучевых повреждений.  Л., 1980.