Роль метода исследования Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР) в диагностике микоплазменных инфекций (на базе клинико-диагностической лаборатории КДЛ «МЕГАЛАБ»)

РЕЗЮМЕ

В результате исследования с 2012 по 2013 гг. 886 пациентов, было выявлено, что частота распространения Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis в ЮКО РК составляет 90% среди пациентов, направляемых врачами на анализ, в то время как среди добровольно сдающих анализ, этот же показатель составляет 10%.

Результаты также демонстрируют, ПЦР – идеальный метод для диагностики скрыто, бессимптомно и хронически протекающих инфекций. ПЦР – самый «используемый» метод в венерологии, урологии, гинекологии и андрологии для точной диагностики БППП. Фактически, на сегодняшний день, только ПЦР может претендовать на звание метода качественной диагностики половых инфекций, который заслуживает доверия.

ТҮЙІН

Полимерлы Тізбекті Реакция (ПТР) зерттеу әдісінің микопламалы инфекцияларды диагностикалаудағы маңызы («МЕГАЛАБ» клинико-диагностикалық зертханасы КДЗ негізінде ). 2012–і мен 2013-і жылдардағы 886 емделушілердің зерттеу нәтижелері Қазақстан Республикасының Оңтүстік Қазақстан облысында, Mycoplasma genitalium және Mycoplasma hominis қоздырушыларының таралу жиілігі дәрігерлердің анализдерге берген жолдамасымен келгендердің 90% анықталса, еркімен анализ тапсырушылардың арасында бұл көрсеткіш 10% құрады. Сол сияқты, дәлелденген нәтижелер ПЦР-ң, жасырын симптомсыз ауруларды және созылмалы инфекцияларды диагностикалауда өте жақсы, пәк әдіс екенін көрсетті. ПЦР – венерологияда, урологияда, гинекологияда және андрологияда қолданылатын әдістердің ең тиянақтылы-нақтысы. Бүгінгі күні, тек ПЦР ғана жыныс инфекцияларын сапалы диагностикалауға болатын сенімді атаққа ие бола алады.

SUMMARY

The role of the research method Polymerase Chain Reaction (PCR) in the diagnosis of mycoplasma infection (based on clinical diagnostic laboratories to clinical laboratories MEGALAB).

Two years research among 886 patients in South Kazakhstan has demonstrated Mycoplasma spread 90% among those patients who were treated by physicians in comparison with self-directed patients where the same indicator was 10 %.

Results demonstrate that PCR is the ideal method for diagnosing hidden, asymptomatic and chronic infections. PCR is the most usable method in venerology, urology, gynecology and andrology for the accurate diagnosis of STDs. In fact, to date, only the PCR can claim to be the method of qualitative and trustworthy diagnosis of genital infections

Список сокращений

ЮКО РК – Южно Казахстанская область, Республика Казахстан

ПЦР –полимеразная цепная реакция

КДЛ – клинико-диагностическая лаборатория

ВЗОМТ – воспалительные заболевания органов малого таза

ЛЦР – лигазная цепная реакция

Амплификация – увеличение числа копий ДНК

Ключевые слова: ПЦР, Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis, заболевания передающиеся половым путем, скрыто текущие инфекции, ДНК-матрица, амплификация, элонгация, праймер, контрольная проба, денатурация – двухцепочной ДНК-матрицы.

Актуальность темы

Публикуемая работа является результатом проведенных анализов клинико-диагностической лабораторией – КДЛ ЮКО «МЕГАЛАБ» за 2012-2013 гг.

MegaLab – специализированная клинико-диагностическая лаборатория, работающая на специализированном оборудовании для проведения высококачественных и быстрых анализов широкого спектра, работает с августа 2011 г. Оборот лаборатории более 600 000 анализов в год. Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis при ряде состояний может вызывать ВЗОМТ — воспалительные заболевания органов малого таза (вагиниты, сальпингиты, оофориты, эндометриты и др.). Распространение микоплазменной инфекции в верхние отделы урогенитального тракта с развитием ВЗОМТ часто приводит к нарушениям репродуктивной функции – невынашиванию беременности, бесплодию, у мужчин – простатитам, везикулитам, снижению потенции.

Ранняя и своевременная диагностика позволяет врачу применять этиотропную терапию и проводить контроль терапии пациента, тем самым снижая риск осложнений.

Цель исследования и методология

Целью настоящего исследования являлось определение частоты распространения Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis среди пациентов, направляемых урологами, гинекологами и венерологами ЮКО и типологии выделяемого агента.

Для решения поставленной цели, авторы исследования использовали автоматический анализатор Rotor-Gene Q, производства USA, с наборами реагентов «АмплиСенс», производства США.

За обозреваемый период с 2012 по 2013 гг. включительно, было обследовано 886 пациентов, среди которых мужчин – 73%, женщин – 27%.

100% обследованных в возрастной группе 20-50 лет. Разбивка на этнические, социальные и иные группы не проводилась. В качестве пилотной группы выступали пациенты, сдававшие анализ на Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis без направления врача. Количество таких пациентов составило 623.

Метод лабораторной диагностики – использовалась ПЦР (полимеразная цепная реакция) и ЛЦР (лигазная цепная реакция).

ПЦР – метод молекулярной биологии, позволяющий добиться увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. С помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В стандартном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определенных условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
• два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК;
• термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК;
• дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP);
• ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы;
• буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции – рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы; при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.

Денатурация – двухцепочную ДНК-матрицу нагревают до 94-96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5-2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.

Отжиг – когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Время стадии отжига – 30 cек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60°C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72°С.

Элонгация – ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3′-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5′ к 3′ концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

Материалом для настоящего исследования служили: соскоб, моча, секрет предстательной железы, сперма, слюна, синовиальная жидкость. Чаще всего материалом для исследования является соскоб из урогенитального тракта (у женщин из цервикального канала, у мужчин – из уретры) [7].

Принцип метода

В КДЛ «МЕГАЛАБ» для выявления инфекции Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis используются наборы реагентов «АмплиСенс». Данный набор предназначен для выявления ДНК Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis путем амплификации специфического фрагмента ДНК методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации.

ПЦР включает в себя 3 этапа: экстракцию (выделение) ДНК из образцов клинического материала, амплификацию фрагмента ДНК Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis и гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Экстракция ДНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-FL), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами ДНК проводится реакция амплификации фрагмента ДНК Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis при помощи специфичных к нему праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с амплифицируемой ДНК-мишенью, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности  флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала при использовании варианта FEP осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного детектора, а при использовании варианта FЕР осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного детектора, а при использовании FRT – непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». Данный метод утвержден директором Федерального государственного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Покровским В.И. в 2009 г.

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвестрируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания. Чем длительнее период выделения, тем больше вероятность выявления возбудителя даже при минимальном количестве.

Для сравнения, в КДЛ «МЕГАЛАБ» это время составляет 3 часа, тогда как в других лабораториях – до 1 часа.

Еще одним преимуществом ПЦР КДЛ «МЕГАЛАБ» является постоянный внешний контроль качества (ВКК) постановки реакции. Фирма-производитель «АмплиСенс» высылает контрольные пробы с заведомо известным только им результатом, которые идут в постановку наряду с другими пробами. Результат проведения реакции контрольной пробы отправляется в Москву. Таким образом, работа ПЦР КДЛ «МЕГАЛАБ» находится под постоянным внешним межреспубликанским контролем качества.

В ходе различных манипуляций в КДЛ «МЕГАЛАБ» ДНК инфекция (если она присутствует в забранном материале) многократно удваивается, пока количество ДНК не станет равным 10⁸-10¹² штук. Это количество ДНК становится заметным для оборудования, которое проводит диагностику.

Диаграмма 1. Результаты исследования пациентов на Mycoplasmagenitalium и Mycoplasmahominis с 2012 по 2013 гг. включительно

Выводы:

1.  Высокая чувствительность и специфичность метода, позволяющая определять 10-1000 клеток в пробе, дает возможность выявления персистирующих, некультивируемых форм микоплазм;

2.  Выявление генетического материала в малом количестве пробы, высокая специфичность, поскольку в исследуемом материале выявляется уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК;

3.  Универсальность процедуры обнаружения различных возбудителей из одной биопробы;

4.  Скорость проведения исследования – быстрое получение результата (4-4,5 ч);

5.  Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций;

6.  Возможность использования разных видов биологического материала в зависимости от места предполагаемой локализации возбудителя. Пробой для ПЦР-диагностики микоплазмы может быть соскоб эпителиальных клеток и отделяемое урогенитального тракта, секрет простаты, мокрота, синовиальная жидкость, моча и др.

7.  ПЦР эффективна для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов. Ее использование целесообразно для выявления возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов [3].

8.  Применение ПЦР эффективно для диагностики широкого спектра бактериальных и вирусных инфекций.

ДНК-диагностика – самая современная на сегодняшний день методика. Ее точность достигает 99%. По соотношению цена/качество/быстрота исполнения – у нее нет аналогов.

ПЦР на сегодня – идеальный метод для диагностики скрыто, бессимптомно и хронически протекающих инфекций. В частности, к таким инфекциям относятся и, практически, все ИППП-инфекции, передаваемые половым путем. Вот почему ПЦР – самый «используемый» метод в венерологии, урологии, гинекологии и андрологии. Фактически, на сегодняшний день, только ПЦР может претендовать на звание метода качественной диагностики половых инфекций, который заслуживает доверия [6].

Литература:

1. Вагорас А., Савичева А., Гален А., Домейка М. Основы микроскопии мазков мочеполового тракта. Каунас: Издательство студия «КАТА», 2001, 42 с.
2. Гервазиева В.Б., Самойликов П.В. Взаимодействие вирусов семейства Herpes viridae с иммунной системой человека // Аллергология и иммунология. 2010, №1, с. 31-41.
3. Гомберг М., Ковалык В.П. Хламидиоз и простатиты // Инфекции, передаваемые половым путем. 2002, №4, с. 3-9.
4. Гущин А.Е., Рыжих П.Г., Савочкина Ю.А и др. Изучение распространенности возбудителей ИППП (C.trachomatis, N.gonorrhoeae, M.genitalium, T.vaginalis) с помощью ПЦР в реальном формате «Мультипрайм» // Клин. дерматол. и венерол. 2011, №4, с. 58-63.
5. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. Москва: Медицинская книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003, 336 с.
6. Долгих Т.И. Современная лаборатория: диагностический потенциал и мониторинг актуальных инфекционных заболеваний. Омск: 2010, 58 с.
7. Исаков В.А., Архипова Е.И., Исаков Д.В. Герпесвирусные инфекции человека: руководство для врачей. СПб.: СпецЛит, 2006, 301 с.
8. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2009, 712 с.
9. Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, р. 341-361.
10. Alice Chien, David B. Edgar, John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermusaquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, p. 1550-1557.

Literaturа:

1.  Vagoras A., Savicheva A., Galen A., Domejka M. Оsnovy mikroskopii mazkov mochepolovogo trakta. Kaunas: Izdatel’stvo studija KATA, 2001. 42 s.

2.  Gervazieva V.B., Samojlikov P.V. Vzaimodejstvie virusov semejstva Herpesviridae s immunnoj sistemoj cheloveka // Allergologija i immunologija. 2010, №1, s. 31-41.

3.  Gomberg M., Kovalyk V.P. Hlamidioz i prostatity // Infekcii, peredavaemye polovym putem. 2002, №4, s. 3-9.

4.  Gushhin A.E., Ryzhih P.G., Savochkina Ju. A i dr. Izuchenie rasprostranennosti vozbuditelej IPPP (C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium, T. vaginalis) s pomoshh’ju PCR v real’nom formate Mul’tiprajm // Klin. dermatol. i venerol. 2011, №4, s. 58-63.

5.  Dmitriev G.A. Laboratornaja diagnostika bakterial’nyh urogenital’nyh infekcij. Moskva: Medicinskaja kniga, N. Novgorod: Izdatel’stvo NGMA, 2003, 336 s.

6.  Dolgih T.I. Sovremennaja laboratorija: diagnosticheskij potencial i monitoring aktual’nyh infekcionnyh zabolevanij. Omsk: 2010, 58 s.

7.  Isakov V.A., Arhipova E.I., Isakov D.V. Gerpesvirusnye infekcii cheloveka: rukovodstvo dlja vrachej. SPb.:SpecLit, 2006, 301 s.

8.  Kishkun A.A. Immunologicheskie issledovanija i metody diagnostiki infekcionnyh zabolevanij v klinicheskoj praktike. M.: OOO Medicinskoe informacionnoe agentstvo, 2009, 712 s.

9.  Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, s. 341-361.

10. Alice Chien, David B. Edgari, John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermusaquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept, 1976, p. 1550-1557.

Контактные адреса авторов статьи:

Мустафина Сабина Сагиндыковна +7 (777) 22 00 646, +7 (701) 818 67 07, sabina_mustafina_84@mail.ru

Дубовицкий Сергей Владимирович +7 (705) 434 45 94, +7 (778) 137 12 43

Махаматалиева Камила Акмаловна +7 (778) 964 30 35, +7 (700) 313 80 75

Место работы авторов: г. Шымкент, ул. Елшибек Батыра, 71, КДЛ «МЕГАЛАБ».