+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

ОСОБЕННОСТИ ПРЕАНАЛИТИЧЕСКОГО ЭТАПА ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В НЕЙРОМОРФОЛОГИИ

Автор: Б.Б. Жетписбаев, Л.Е. Мукалыкова,Л.Ж. Калиева, К.Т. Манабаева
Место работы: Ао «Национальный центр нейрохирургии» Казахстан, Астана

Аннотация

Иммуногистохимический аналитический этап исследования подготовки комплексного технологического исследования является важным моментом в  процессе приготовления препарата. В данной статье подробно описан иммуногистохимический аналитический метод. 

Цель работы: подробно описать особенности преаналитического этапа иммуногистохимических исследований в нейроморфологии.

Результаты работы: будет подобран и адаптирован в условиях Национального центра нейрохирургии протокол преаналитического этапа иммуногистохимических исследований.

Область применения результатов: патоморфология, клиническая лабораторная диагностика, онкология.

Ключевые слова: преаналитический этап, иммуногистохимия, опухоль, лаборант-гистолог.

В последние годы из-за введения новых стандартов верификации и лечения злокачественных опухолей нервной системы резко возросли требования к точной и своевременной диагностике этих заболеваний. Как известно, оонкологический диагноз основывается на достоверной патоморфологической верификации опухолевого процесса. Выбор схемы дальнейшего лечения и прогнозирование течения заболевания всецело зависит от его точности. Недавно опубликованные Всемирной организацией здравоохранения и Международным противораковым агентством в Лионе (IACR) (1999-2010 гг.) классификационные характеристики опухолей ЦНС предусматривают обязательное использование во многих случаях молекулярно-генетических и молекулярно-биологических методов верификации новообразований [1, 2]. Такое усложнение требований к диагностике вызвано современными возможностями и требованиями онкологической клиники, а также необычайным разнообразием генетических аномалий, возникающих в раковой клетке.

Классификационные характеристики опухолей ЦНС предусматривают обязательное использование во многих случаях иммуногистохимических и молекулярно-генетических методов верификации новообразований. Иммуногистохимия – это один из методов окраски биологических объектов, изучаемых под микроскопом, имеющий сложный технологический процесс. Весь процесс приготовления иммуногистохимических препаратов можно условно разделить на 3 этапа: преаналитический, аналитический и постаналитический [2, 3, 4].

Цель

изучить протоколы приготовления иммуногистохимических препаратов, подобрать и адаптировать протоколы к работе Патологоанатомического отделения АО «Национальный центр нейрохирургии».

Материалы и методы

Изучено более 15 протоколов приготовления иммуногистохимических препаратов. При изучении протоколов большое внимание уделялось особенностям преаналитического этапа иммуногистохимических исследований в нейроморфологии. 

Результаты и их обсуждения

Нами было проведено более 500 иммуногистохимических исследований. Преаналитический этап осуществлялся лаборантом-гистологом и включал в себя забор и фиксацию биоматериала, гистологическую проводку, получение срезов на микротоме, подготовку стекол со срезами к окраске. 

Взятие биоматериала один из ответственных этапов, поскольку большинство артефактов взятия зачастую ограничивают возможность использования не только иммуноморфологических методов, но и обычной обзорной окраски: подсыхание кусочка до начала фиксации, сдавливание пинцетом и др. Поэтому нельзя допускать подсыхания, размозжения фрагментов опухолевой ткани [5, 6, 7]. Фрагменты ткани вырезались острым ножом и максимально быстро помещались в фиксирующую жидкость. В качестве фиксатора использовали строго 10% нейтральный (забуференный) формалин. Фиксацию проводили при комнатной температуре, не менее 12 и не более 24 часов (в зависимости от размера образца). Соотношение фиксатор-образец составляло 20:1 по объему. Не следует отождествлять время пропитывания образца фиксатором и сам процесс фиксации. Формалин полностью пропитывает образец за считанные часы, а фиксация – это химический процесс. Формирование перекрестных связей между молекулами белков заканчивается не ранее 24 часов с момента погружения образца в фиксатор. Стоит отметить, что крайне нежелательно пролонгировать время фиксации, так как при длительной фиксации наступают необратимые изменения, и часть антигенов выявить не удастся. Поэтому по истечении указанного времени фиксации, ткань переносили в 70% спирт для прекращения действия фиксатора. Очень важно понимать, что подавляющее большинство всех неудач иммуногистохимических исследований кроются именно в неадекватной фиксации.

Следующим моментом преаналитического этапа — гистологическая проводка. Целью проводки было полное прекращение в образце опухолевой ткани всех химических реакций. В проводке применяли спирты восходящей концентрации, последний из которых 100%. Имеющийся в продаже 96% этанол не обеспечивает полное удаление воды из объектов и поэтому в большинстве случаев не пригоден для качественной проводки [3]. Вместо 100% спирта можно использовать абсолютный изопропанол, деол-абсолют [8, 9]. В качестве просветлителей используют много разных веществ: ксилол, толуол, хлороформ, d-лимонен. Ряд авторов считают, что для качественного результата в иммуногистохимии пригодны лишь алифатические углеводороды и их смеси (например сlear-Rite, формула 83 и др.) [10]. Нами в качестве просветлителей используется О-ксилол. 

При формировании парафинового блока, температура парафина составляла 56 – 600 С, так как более высокая температура ведет к разрушению антигенов. 

Процедура получения гистологических срезов выполнялась с использованием качественного ротационного микротома и одноразовых лезвий высокого качества. Ротационные микротомы позволяют получить более тонкие срезы, чем санные, поэтому они эффективнее для приготовления иммуногистохимических препаратов [6]. Сбор срезов проводился на дистиллированную воду с температурой 45 – 500 С. Срезы были лишены складок, морщин и пузырей воздуха под ними. Эти дефекты являются одной из причин отпадания срезов от стекол в последующих процедурах. Срезы помещались на стекла покрытые поли-L-лизином. Возможно, использовать специально положительно заряженные стекла (+). Парафин удалялся со срезов помещением стеклопрепаратов в сухожаровой шкаф при температуре 60-800 С. Препараты оставляли минимально на 2 часа, максимально на 18 часов (на ночь). 

На этом преаналитический этап иммуногистохимических исследований заканчивался, стеклопрепараты передавались врачу-лаборанту для проведения аналитического этапа. 

Выводы

Преаналитический этап иммуногистохимических исследований является важнейшим моментом в сложном технологическом процессе приготовления препаратов. Дефекты, возникшие на данном этапе, повлекут за собой неправильные и неспецифические иммуногистохимические реакции, что приведет к неверной верификации врачом-патологом опухолевого процесса. 

Список литературы:

1. Мацко Д.Е. Соколова И.А. Роль иммуногистохимии в современной нейроонкологии. Материалы конференции «Поленовские чтения». — СПб., — 2006. 

2. Иммуногистохимические методы: Руководство / Ed. by George L. Kumar, Lars Rudbeck / Пер. с англ. под ред. Г.А.Франка, П.Г.Малькова. – М., — 2011, — 224 с.

3. Райхлин Н.Т., Букаева И.А. Значение определения скорости прохождения клеточного цикла в оценке пролиферативной активности опухолевых клеток. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей под реакцией С.В.Петрова и Н.Т.Райхлина. – Казань, — 2012.

4. Коршунов А.Г., Лахтеева С.В. Иммуногистохимическое изучение экспрессии маркеров в метастатических опухолях головного мозга.  Вестник новых медицинских технологий № 3(электронный журнал), — 1997.

5. Мацко Д.Е. Коршунов А.Г. Атлас опухолей ЦНС. — СПБ, — 1998.

6. Коршунов А.Г., Лахтеева С.В. Иммуногистохимическое изучение экспрессии тенасцина в метастатических опухолях головного мозга. // Вестник новых медицинских технологий № 3, -1997.

7. Коршунов А.Г. Иммуногистохимия в дифференциальной диагностике первичных и метастатических опухолей головного мозга.  Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей под реакцией С.В.Петрова и Н.Т.Райхлина. – Казань, — 2004.

8. Мацко Д.Е. Иммуногистохимическая диагностика первичных и метастатических опухолей центральной нервной системы. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей под реакцией С.В.Петрова и Н.Т.Райхлина. – Казань, — 2012.

9. Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK. WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System. Lyon, — 2007.

10. Мацко Д.Е., Ковальский Г.Б. Инструкция по принципам унифицированной диагностики и регистрации опухолей ЦНС. — СПб, — 2010.

References

1. Matsko D.Ye. Sokolova I.A. Rol’ immunogistokhimii v sovremennoy neyroonkologii . Materialy konferentsii « Polenovskiye chteniya » . — SPb ., — 2006.

2. Immunogistokhimicheskiye metody : Rukovodstvo / Pod red. Dzhordzh L. Kumar , Lars Rudbek / Per . s angl . pod red . G.A.Franka , P.G.Mal’kova . — M. , — 2011, — 224 s.

3. Raykhlin N.T., Bukayeva I.A. Znacheniye opredeleniya skorosti prokhozhdeniya kletochnogo tsikla v otsenke proliferativnoy aktivnosti opukholevykh kletok. Rukovodstvo po immunogistokhimicheskoy diagnostike opukholey pod reaktsiyey S.V.Petrova i N.T.Raykhlina. — Kazan’, — 2012.

4. Korshunov A.G., Lakhteyeva S.V. Immunogistokhimicheskoye izucheniye ekspressii markerov v metastaticheskikh opukholyakh golovnogo mozga. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy № 3 (elektronnyy zhurnal), — 1997.

5. Matsko D.Ye. Korshunov A.G. Atlas opukholey TSNS. — SPB, — 1998.

6. Korshunov A.G., Lakhteyeva S.V. Immunogistokhimicheskoye izucheniye ekspressii tenastsina v metastaticheskikh opukholyakh golovnogo mozga. // Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy № 3, -1997.

ТҮЙІНДЕМЕ 

НЕЙРОМОРФОЛОГИЯДАҒЫ ИММУНОГИСТОХИМИЯЛЫҚ ЗЕРТТЕУЛЕРДІҢАНАЛИТИКАЛЫҚ КЕЗЕҢІ КЕЗІНДЕГІ ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ

Б.Б. Жетпicбаев, Л.Е. Мукалыкова,Л.Ж. Калиева, К.Т. Манатбаева

«Ұлттық нейрхирургия орталығы» АҚ

Қазақстан, Астана

Иммуногистохимиялық зерттеулердің аналитикалық кезеңі препараттарды дайындаудың күрделі технологиялық процессіндегі маңызды сәт болып табылады. Мақалада иммуногистохимиялық зерттеулердің аналитикалық кезеңін жүргізудің әдісі жете баяндалған. Аталған кезеңде туындаған ақаулар қате және спецификалық емес иммуногистохимиялық реакциялар туғызады, бұл ісік барысының дәрігер-патологпен дұрыс анықталмауына әкеліп соғады.

Түйін сөздер: аналитикалық кезеңі кезінде, иммуногистохимия, ісік, зертханашы-гистолог.

Summary

 FEATURES OF PREANALYTICAL PHASE OF IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES IN NEUROMORPHOLOGY 

B. Zhетpіsbаеv, L. Mukalykova, L. Kaliyeva, K. Manabayeva 

«National center of neurosurgery»     

Kazakhstan, Astana

Preanalytical phase of immunohistochemical studies is an important point in the complex process of preparing samples. The article describes the method of pre-analytical stage immunohistochemical studies in detail. Defects caused by this stage will entail wrong and nonspecific immunohistochemical reactions that lead to incorrect verification of cancer pathology by a physician-pathologist.

Keywords: pre-analytical phase, immunohistochemistry, tumor, laboratory-histologist.