+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТВОЛОВЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

Автор: Кустова Е.А., Уразалиева Н.Т., Булегенова М.Г., Билялова К.И.
Место работы: Научный центр педиатрии и детской хирургии, г. Алматы

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток – быстро развивающаяся технология, которая позволяет добиться успеха при лечении злокачественных заболеваниях крови (лейкемии, лимфомы, миеломы) и других гематологических заболеваний (первичный иммунодефицит, апластическая анемия, миелодисплазия). Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток может быть аутогенной, при которой используют стволовые клетки самого пациента, выделенные из периферической крови, и аллогенной, когда используют костный мозг или пуповинную кровь донора.

Для проведения успешной трансплантации необходимо определение количества гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в периферической крови и костном мозге, которое достаточно давно и подробно охарактеризованы иммунологически [1]. Иммунофенотипическая характеристика ГСК включает определение базисных характеристик стволовой клетки – светорассеяния лазерного луча, определяющих размер и степень гранулярности, а также уровней экспрессии CD34 и CD45 на мембране клеток пула ГСК. Известно, что клетки пула ГСК имеют низкие параметры бокового светорассеяния (SSC-low), то есть, количество клеточных включений минимально [2].

Молекула CD34 является стадиеспецифичным антигеном, определяющим клетки ранних этапов дифференцировки. Показано, что при достаточной морфологической однородности CD34+ клетки гетерогенны по функциональным свойствам и уровню пролиферативной активности. Установлено, что по мере дифференцировки клетки от истинно стволовой (обладающей широким спектром возможностей к дифференцировке и пролиферации) до унипотентной (способной к дифференцировке только по одному ростку кроветворения) репопулирующая способность и потенциал пролиферации снижаются [3].

Известно, что уровень экспрессии панлейкоцитарного антигена CD45 представлен на всех гемопоэтических клетках по-разному, по мере дифференцировки клеток его экспрессия нарастает. Сопоставление уровней экспрессии CD34 и CD45 позволяет идентифицировать ГСК в биологическом материале [4].

Целью данного исследования явился сравнительный анализ определения стволовых гемопоэтических клеток в процессе афереза.

В данной публикации приводятся результаты иммуноцитофлюориметрического исследования стволовых гемопоэтических клеток периферической крови и костного мозга, полученных в ходе ауто- и аллотрансплантаций в Научном центре педиатрии и детской хирургии, где в 2013 году была освоена и внедрена трансплантация гемопоэтических стволовых клеток с целью улучшения лечения онкогематологических и других заболеваний.

Всего было проведено 11 ауто- и 3 аллотрансплантации.

Аллотрансплантацию проводили детям с острым лимфобластным лейкозом, острым миелобластным лейкозом, миелодиспластическим синдромом; аутотрансплантацию – детям с лимфомой Ходжкина, нейробластомой, ретинобластомой.

Материал и методы

Пробоподготовка для выявления ГСК в периферической крови и костном мозге осуществлялась при помощи двухплатформенного метода по принципу окрашивание-лизис-отмывка. Клетки (не менее 2-3×106/мл) были окрашены в течение 15 минут CD45 FITC, CD34 PE, (Becton Dickinson, USA) из набора Stem Cell Enumeration Kit. Для лизирования эритроцитов был внесен раствор Ammonium Chloride Lysing Solution, подготовленный согласно рекомендациям производителя. Далее был добавлен 7-AAD (7-амино-актиномицин D) для окрашивания нежизнеспособных клеток. Клетки были анализированы на проточном цитометре FacsCanto II в течение часа.

Разработанный алгоритм получения и анализа данных включал:

– определение содержания ядросодержащих событий;

– идентификация кластера CD45+ событий на проточном цитофлюориметре;

– при помощи специальной функции цитометра из анализа исключаются нежизнеспособные клетки 7-AAD+;

– гейтирование кластера CD45+CD34+ позитивных событий по параметрам светорассеяния осуществляется на основе живых ЯСК (ядросодержащих клеток).

Абсолютное количество стволовых гемопоэтических клеток рассчитывалось на основании показателей относительного количества CD45+CD34+ клеток, объема полученного образца и массы тела реципиента. Многолетний опыт трансплантаций костного мозга и периферической крови за рубежом свидетельствует о том, что для успешного восстановления кроветворения необходимо собрать не менее 3х106/кг CD34+ стволовых гемопоэтических клеток. Это является ключевым моментом для исхода трансплантации [5].

Результаты и обсуждение 

Для определения ГСК мы использовали двухплатформенный метод, который, на наш взгляд, является наиболее удобным и точным. Он включает в себя определение ЯСК на гематологическом анализаторе, и цитофлюориметрическое описание параметров CD34+ клеток. В последующем просчитывается абсолютное количество стволовых клеток, позволяющих судить о достаточном их количестве в каждом конкретном образце.

Относительное содержание CD45+ событий было оценено при исследовании образцов, окрашенных антителами FITC. Всего собиралось не менее 500 000 событий, в гейте CD45+CD34+ – не менее 100. При концентрации ЯСК в образце более 100×109/л образец разводится в определенных соотношениях (рис. 1,2,3).

Как показано в таблицах 1,2, средний процент CD34+ в образцах при аутологичных трансплантациях с добавлением клеточного криопротектора ДМСО составил 2,8±0,3, костного мозга – 2,7±0,7. В пересчете на абсолютные значения (на кг массы тела) это составило 6,1±1,0 и 2,7±2,5, соответственно. В среднем, как показано в таблицах 1,2, количества ГСК было достаточным как при ауто-, так и при аллотрансплантациях.

Только в одном случае аутотрансплантации было собрано недостаточное количество ГСК, что выражалось как в низком относительном количестве (1,0%), так и в недостаточном содержании CD34 на кг массы тела пациента (1,4×106/кг).

Выводы

Таким образом, включение протокола определения количества CD34+ клеток в процедуру ауто- и аллотрансплантации позволяет оценить количественное содержание малоклеточной популяции ГСК в продукте афереза.

В ходе проведения методики определения CD34 использовались параметры точной верификации ГСК путем иммунофлуресценции в образце:

 – светорассеяние лазерного луча: показатель бокового светорассеяния для них всегда низкий SSC-low, то есть оптическая плотность клеточной цитоплазмы невысока, а количество клеточных включений минимально;

 – более низкий уровень экспрессии CD45 антигена на стволовых клетках по сравнению с уровнем их на зрелых лимфоцитах.

Общепринятое количество CD34+ клеток для успешной трансплантации считается не менее 3×106/кг CD34+, следовательно, в ходе проведения процедур ауто- и аллотрансплантации стволовых гемопоэтических клеток у детей было получено достаточное количество CD34+ клеток. Для успешной трансплантации главное – содержание CD34 в аферезном продукте, но не содержание ЯСК, то есть предиктором качества запланированного афереза является сбор достаточного количества ГСК с целью дальнейшего введения их пациентам.

У всех пациентов после ГСК получен хороший клинический эффект. Однако, количество стволовых клеток, инфузируемых пациенту при ауто- и аллотрансплантации не является единственным условием, определяющим успешность трансплантации. Большое значение имеют режим кондиционирования, возраст пациента, степень совместимости по системе HLA донора и реципиента и ряд других факторов.

Литература:

  1. Андреева Л.Ю., Тупицын Н.Н. Субпопуляции периферических стволовых гемопоэтических клеток (ПСГК). Проточно-цитофлюориметрическая идентификация ПСГК на основании светорассеяния, экспрессии CD34, CD45, AC133. / Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2002. – Т.1. – №1. – с. 60-65
  2. Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н. Субпопуляции трансплантируемых стволовых кроветворных клеток / Онкогематология. – Т. 08. – №1. – 2006. – с. 65-71
  3. Зубаровская Л.С., Фрегатова Л.М., Афанасьев Б.В. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при гемобластозах // Клиническая онкогематология: Руководство для врачей/ п/р профессора М.А. Волковой. – М. –Медицина. – 2007. – с. 912
  4. Зуева Е.Е., Куртова А.В., Русанова Е.Б., Горчакова М.Б., Слободнюк К.Ю. Количественный учет гемопоэтических стволовых клеток / Проточная цитометрия в медицине и биологии. – Алматы. – 2011. –с. 261
  5. Масчан А.А., Румянцев А.Г. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей. – М.: Мед. информ. Агентство. – 2003