МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Кожамкулов Улан Анетович

к.м.н, ведущий  научный сотрудник, РГП «Национальный центр

биотехнологии РК» КН МОН РК, Астана, Казахстан

kzulan@gmail.com

Шевцов Александр Борисович  

к.б.н, старший  научный сотрудник, РГП «Национальный центр

биотехнологии РК» КН МОН РК, Астана, Казахстан

Ахметова Айнур Жармухамбетовна

бакалавр, младший  научный сотрудник, РГП «Национальный центр

биотехнологии РК» КН МОН РК, Астана, Казахстан,

ЕНУ им. Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан

Тарлыков Павел Викторович

  магистр, научный сотрудник, РГП «Национальный центр

биотехнологии РК» КН МОН РК, Астана, Казахстан,

ЕНУ им. Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан

Мухамедьяров Дамир Адильевич

бакалавр, младший  научный сотрудник, РГП «Национальный центр

биотехнологии РК» КН МОН РК, Астана, Казахстан,

ЕНУ им. Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан

Раманкулов Ерлан Мирхайдарович

PhD, генеральный директор, РГП «Национальный центр

биотехнологии РК» КН МОН РК, Астана, Казахстан

Аннотация

Молекулярно-генетическое определение лекарственной устойчивости к антибиотикам и противовирусным препаратам используется в клинической практике во многих странах мира. Кроме того,  существуют многочисленные данные о взаимосвязи генотипов с клиническим течением болезни и терапевтическим эффектом. Использование молекулярно-генетических подходов в настоящем исследовании хорошо иллюстрируется двумя примерами:  оценка спектра и распространенности мутаций в генах, обуславливающих резистентность к протвотуберкулезным препаратам  рифампицину и изониазиду среди штаммов, изолированных на территории Казахстана,  а также  изучение генетического распределения и оценки лекарственной устойчивости вируса гепатита В у пациентов, обследованных в  г. Астана.

Ключевые слова: инфекционные заболевания, туберкулез, M.tuberculosis, лекарственная устойчивость, генотипирование, вирусный гепатит В 

Введение

В настоящее время молекулярно-генетические методы нашли широкое применение в медицине для изучения инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы.Во всем мире наиболее актуальной проблемой, препятствующей борьбе с туберкулезом, является развитие у M. tuberculosisустойчивости к лекарственным препаратам, что ведёт к снижению эффективности и увеличению сроков химиотерапии, а так же к росту лекарственно-устойчивого туберкулеза в различных регионах мира, согласно данным WHO report (2009), WHO (2008), Okeke и соавт. (2005), Maher и соавт. (2005), Raviglione и соавт. (2003), Aziz и соавт. (2006). По данным ВОЗ в 2007г. насчитывалось приблизительно 0,5 миллиона случаев ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (ТБ-МЛУ). 85% таких случаев приходится на 27 стран (из которых 15 — в Европейском регионе, включая Казахстан).

После распада СССР в 1991 г. произошли политические и социально-экономические перемены, повлиявшие на систему здравоохранения и общий уровень жизни населения, ухудшились социально-бытовые условия жизни населения, увеличилась безработица. По данным Toungoussova и соавт. (2006) в это же время, в странах Восточной Европы и бывшего СССР, началось увеличение эпидемиологических показателей по туберкулезу и в том числе показателей по лекарственно-устойчивому туберкулезу. В последние годы в странах бывшего СССР отмечено распространение штаммов M. tuberculosisсемейства Beijing, ассоциированных с высоким риском распространения лекарственной устойчивости Nikolayevskyy и соавт. (2007), Kovalev и соавт. (2005), Mokrousov и соавт. (2008). В Казахстане, по данным Национального центра проблем туберкулеза Абильдаев Т.Ш. (2011), заболеваемость туберкулёзом в 2010г. составляла 95,3 на 100 тысяч населения, а смертность составляла 10,6 на 100 тысяч населения.

Основное значение при лечении туберкулеза, несомненно, имеет устойчивость к основным и наиболее эффективным в настоящее время препаратам – изониазиду и рифампицину. Одновременная устойчивость к этим двум препаратам, трактуется как множественная лекарственная резистентность (Multidrug resistance — MDR). Такой вид специфического поражения легочной ткани получил определение как мультирезистентный туберкулез Schwúbel и соавт. (2000). Заболеваемость туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью в период с 2003 по 2010 гг. увеличилась в 2 раза и составляла в 2010г. — 10,5 на 100 тысяч населения. Таким образом, в Казахстане сохраняются высокие показатели заболеваемости и смертности, увеличивается заболеваемость мультирезистентными формами туберкулеза, что является весьма серьезной проблемой, которая усложняет борьбу с этим заболеванием.

В современной эпидемиологии туберкулеза важным компонентом является изучение вопроса и закономерностей развития эпидемии туберкулеза, изучение причин и факторов, способствующих распространению штаммов M.tuberculosis, обладающих определенными свойствами. Для этого проводится идентификация и специфическая характеристика штаммов по определенным признакам, что позволит решать такие вопросы, как его происхождение, выявление источника инфекции, вероятные пути и факторы передачи, а так же выявлять случаи возникновения и распространения устойчивости к химиотерапевтическим препаратам Афанасьев (2008). В этом направлении молекулярно-генетические подходы типирования M.tuberculosis получило развитие и внедрение в лабораторную практику. Они базируются на обнаружении отличий в структуре и частоте встречаемости определенных генетических элементов среди различных штаммов M.tuberculosis.

Инфекционный вирусный гепатит В остается глобальной проблемой здравоохранения с высоким уровнем инфицирования и смертности. По данным Mahtab и соавт. (2008), приблизительно 5% мирового населения заражены вирусом гепатита B, около 400 миллионов являются хроническим носителями гепатита В, из которых 75% — 80% проживают в Азии и западной Океании. Современная классификации подразделяет вирус гепатита В на 8 различных генотипов, обозначающие буквами алфавита от А до Н. Деление основано на генетическом отличие полных геномов вируса не менее чем на 8%. Генотипы от А до D а также генотип F, делятся на субгенотипы генетическая вариабельность между которыми составляет от 4 до 8% Schaefer (2007). Генотипам вируса гепатита В свойственно устойчивое географическое распределение. В Юго-Восточной Азии и Океании превалируют генотипы В и С, тогда как в западноевропейских странах наиболее распространены А и D генотипы. Генотип D является преобладающим в Средиземноморском бассейне, на Ближнем Востоке и Средней Азии. В северной Америке преобладает генотип C затем по убыванию А и В. Генотип E встречается в Африке, F – у коренных жителей Америки и Полинезии, генотип G – распространен в США и Франции, а генотип H преимущественно регистрируется в центральной Америке Mahtab и соавт. (2008).

Важность генотипирования связано не только с эпидемиологическим значением, но также отмечена корреляция между клиническим течением гепатита В и его генотипами. Так по данным McMahon (2009), высокий риск развития гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) связан сгенотипами C, B2-5, и F1, в то время как низкий риск развития НСС связан с генотипами B1, B6, и A2. Существует взаимосвязь генотипов с элиминацией HBeAg, а также противовирусным лечением Maeshiro и соавт. (2007).

Результаты и обсуждение

Генотипирование мультирезистентных изолятов M. tuberculosis

Лекарственная чувствительность M. tuberculosis к изониазиду и рифампицину определялась методом абсолютных концентраций, согласно рекомендациям ВОЗ. Амплификацию фрагментов rpoB и katG,промоторной областиоперона fabG-inhA, oxyR-ahpC M.tuberculosis проводили в амплификаторе. ДНК секвенирование с последующим определением нуклеотидных последовательностей rpoB, katG,промоторной областиоперона fabG-inhA, oxyR-ahpC геновосуществляли с помощью генетического анализатора ABI 3730 (Applied Biosystems). Проведено генотипирование мультирезистентных штаммов M. tuberculosis методом сполиготипирования.

В нашем исследовании были определены мутации, обуславливающие устойчивость к рифампицину и изониазиду у мультирезистентных изолятов (рифампицин и изониазид устойчивых), циркулирующих в различных регионах Казахстана. Для генетических исследований изучалась выборка из 479 клинических изолятов M. tuberculosis, включающая415 мультирезистентных изолятов (изоляты устойчивые к рифампицину и изониазиду), 51 изониазид-устойчивых изолятов и 13 рифампицин-устойчивых изолятов. Нуклеотидные замены, приводящие к устойчивости к рифампицину, в основном встречаются между 507 и 533 кодонами rpoB гена, так называемом регионе, определяющем устойчивость к рифампицину (rifampin resistance determinant region (RRDR)). Среди 428 рифампицин-устойчивых клинических изолятов мутации были обнаружены у 97,0% изолятов. Было выявлено 16 различных вариантов мутаций в 7 кодонах Ser531, His526, Asp516, Leu533, Gln510, Leu 511, Ser 512. Большинство нуклеотидных замен приходится на 531 кодон rpoB гена и составляет 83,9%, где выявлено 4 различных вариантов однонуклеотидных замен с преобладанием замены серина на лейцин (80,6%). Следует отметить, что Казахстан находится между двумя крупными государствами – Россией и Китаем, где хорошо изучены спектры мутаций в rpoBгене клинических изолятов M.tuberculosis. Частота мутаций в rpoBгене казахстанских штаммов отличается от частоты мутаций в rpoB гене штаммов M.tuberculosis из России и Китая, при этом отмечается увеличение доли мутаций в 531 кодоне рифампицин-устойчивых штаммов M.tuberculosis, циркулирующих на территории Казахстана, в отличии от циркулирующих штаммов в соседних странах.

Мутации, определяющие резистентность к изониазиду, исследовались в гене katG, промоторной областиоперонаfabG—inhA, oxyR—ahpC 466 изониазид-устойчивых изолятов M.tuberculosis. Среди изониазид-устойчивых клинических изолятов мутации в генах, определяющие устойчивость к изониазиду, были обнаружены в 99,8%. В гене katG у 98,5% выявлена мутация в 315 кодоне, приводящая к замене аминокислоты серина на треонин, включая в 7,1% двойные мутации т.е. замены одновременно в katG гене и -8 и -15 позиции промоторной области mabA(fabG)–inhA оперона.

Проведено генотипирование 148 мультирезистентных штаммов M. tuberculosis, где определены семейства, циркулирующих в Казахстане штаммов, среди них преобладающим генотипом является генотип семейства Beijing (87,2%), остальные составляют соответственно LAM – 6,0%, T1 – 4,1%, T4 – 2,7%. В таблице 1 показаны выявленные генотипы среди 148 образцов из девяти областей Республики Казахстан.

Таблица 1

Результаты сполиготипирования клинических штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в Казахстане

№	Семейство	Число штаммов (%)
1	Beijing	129 (87,2)
2	LAM	9 (6,0)
3	T1	6 (4,1)
4	T4	4 (2,7)

Сполиготип для каждого штамма записывался в двоичном формате, где для каждого из 43 спейсерных промежутков DR-региона единицей (1) обозначалось наличие сигнала, а нулем (0) – его отсутствие. Для определения семейства, к которому относился штамм, использовалась ранее опубликованная база SpolDB4. Международный сполиготип (Spoligotype International Type; SIT) каждого штамма определялся путем сравнения полученных результатов с базой данных SPOTCLUST (http://cgi2.cs.rpi.edu/~bennek/SPOTCLUST.html).

На основании результатов сполиготипирования выделено четыре кластера, содержащих от 2 до 67 штаммов, имеющих идентичный сполигопаттерн. Наибольший кластер – 129 (87,2 %) штаммов – был образован штаммами, относящимися к семейству W-Beijing.

Генотип Beijing является отличительным для нашего региона семейством туберкулеза. В 1995 году изоляты M. tuberculosisс похожей характеристикой были найдены в Пекине (на английском “Beijing”), и были названы семейством “Beijing”. Штаммы этого семейства наиболее вирулентные, этот генотип также имеет ассоциацию с лекарственной устойчивостью.Этот генотип преобладает среди молодых индивидуумов и является показателем роста передачи туберкулеза в данное время. Данный генотип повсеместно распространяется во многих регионах мира, в том числе в регионах, где ранее он не обнаруживался.

Генотипирование и определение лекарственной устойчивости вируса гепатита В

В исследование по генотипированию вируса гепатита В было включено 115 образцов ДНК, выделенных из плазмы крови пациентов с хроническим гепатитом В. Для амплификации фрагмента полимеразного гена были использован вложенный (nested) ПЦР с праймерами, описанными Vincenti и соавт. (2009). Определение нуклеотидной последовательности осуществляли с использованием автоматического генетического анализатора 3730xl DNA Analyzer, комплекта реагентов BigDye terminator cycle sequencing kit v 3.1 и внутренних праймеров.

Обработка нуклеотидных последовательностей и анализ аминокислотных замен, обуславливающие лекарственную устойчивость, осуществлен с использованием программного обеспечения SeqScape 2.6.0 (Applied Biosystems). Определение генотипов было осуществлено построением филогенетических деревьев с использованием Mega 5.05 и метода присоединения ближайших соседей (Neiighbor-Joining, NJ). В анализ были включены референтные последовательности различных генотипов вируса гепатита В, взятые из базы данных Gene Bank http://www.ncbi.nih.gov (рисунок 1). 

Рисунок 1. Филогенетическое дерево изолятов идентифицированных как генотип D. Mega 5.05, метод Neighbor-joining. ▲ – обозначаются референтные последовательности из Gene Bank c указанием генотипа и инвентарного номера

Филогенетический анализ 115 обработанных нуклеотидных последовательностей вируса гепатита B с референтными последовательностями позволил идентифицировать у 93% пациентов генотип D (n-107)¸ генотип А установлен в 4,35% (n-5) случаев, а генотип С в 2,6 % (n-3).

Как видно на рисунке 1 нуклеотидные послеледовательности гепатита В от 69 (60%) пациентов расположены на одной кладе с референтными последовательности субгенотипа D1. К субгенотипу D2 можно отнести нуклеотидные последовательности от 13 пациентов (11,3%), а 20 (17,4%) последовательностей гепатита В находятся на кладах с референтными последовательностями D3 субгенотипов. Нуклеотидные последовательности от 5 (4,3%) пациентов с генотипом D не удалось субгенотипировать филогенетичским анализом, и они располагаются отдельной кладой.

Анализ аминокислотной последовательности позволил выявить аминокислотную замену T184S, обуславливающая устойчивость к ламивудину в 0,9% (1/115), а к адефовиру (Q215S) в 2,6% (3/115) случаев хронического гепатита В. Низкий процент лекарственной устойчивости вируса гепатита В к нуклеотид(зид)ным препаратам связан с внедрением данных лекарственных препаратов в клиническую практику только в последние несколько лет.

Генотипирование вируса гепатита В широко используется во всем мире, но информация о распределении генотипов в некоторых частях мира отсутствует или представлена ограниченным числом образцов. Несмотря на то, что территория Казахстана высокоэндемична по гепатиту В, мы нашли только один литературный источник Tallo и соавт. (2008) о генотипировании вируса гепатита В, циркулирующего на территории Казахстана, представленный лишь двумя образцами. Наше исследование показывает, что в г. Астана доминирует генотип D, на долю которого приходится около 93% случаев. Распределение генотипов отличается от Восточных и Юго-Восточных Азиатских стран, где доминируют С и В генотипы, за исключением Монголии где, по данным Tsatsralt-Od и соавт. (2006), уровень генотипа D составляет 98,5%. Распределение генотипов в Казахстане наиболее идентично странам Среднего Востока, в которых генотип D встречается примерно от 80% (Египет, Саудовская Аравия, Кувейт) до 100 % (Иран, Турция), причем в последних субгенотип D1 встречается в 94-98%. Необходимо отметить, что в Таджикистане, Узбекистане и России также преобладает генотип D, при этом в России 87% генотипов D относятся к субгенотипу D2.

Таким образом, по результатам наших исследований, было выявлено, что для популяции M. tuberculosis, циркулирующей на территории Казахстана, характерна высокая частота встречаемости мутаций в горячих точках гена rpoB, обуславливающем устойчивость к рифампицину и мутации в katG-гене, определяющем устойчивость к изониазиду. По результатам исследования штаммов M. tuberculosis выделенных на территории Казахстана, наблюдается преимущественное распространение MDR-штаммов, отличающихся от штаммов, циркулирующих в соседних странах, с преобладанием генотипа Beijing. Распределение генотипов вирусного гепатита В, отличается от близлежащих азиатских стран например Китая, где доминирующим является генотип С, но идентично распределению генотипов в России. По нашим результатам, в Казахстане доминирует генотип D, на долю которого приходится около 93% случаев. 

Литература

1. Абильдаев Т.Ш. Статистический сборник по туберкулезу по Республике Казахстан: Национальный центр проблем туберкулеза МЗ РК, 2011, 68с.
2. Афанасьев М. В. Молекулярное типирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. Диссертация, Москва, 2008, 150с.
3. Anti-tuberculosis drug resistance in the world Fourth Global Report: The WHO/IUATLD Global Project on Anti-tuberculosis Drug Resistance Surveillance 2002-2007. World Health Organization 2008.
4. M. A. Aziz, A. Wright, A. Laszlo, A. De Muynck, F. Portaels, A. Van Deun, Ch. Wells, P. Nunn, L. Blanc, M. Raviglione Epidemiology of antituberculosis drug resistance (the Global Project on Anti-tuberculosis Drug Resistance Surveillance): an updated analysis Lancet 2006; 368: 2142–54.
5. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing: WHO report 2009, 303p.
6. Kovalev, E. Y. Kamaev, M. A. Kravchenko, N. E. Kurepina, S. N. Skorniakov Genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping INT J TUBERC LUNG DIS 2005 9(7):746–752.
7. D. Maher, M. Raviglione Global Epidemiology of Tuberculosis Clin Chest Med26 (2005) 167 – 182.
8. T. Maeshiro, S. Arakaki, T. Watanabe, H. Aoyama, J. Shiroma, T. Yamashiro, T. Hirata, A. Hokama, F. Kinjo, T. Nakayoshi, T. Nakayoshi, M. Mizokami, J. Fujita, H. Sakugawa. Different natural courses of chronic hepatitis B with genotypes B and C after the fourth decade of life. World J Gastroenterol, 2007. 13: р. 4560-4565.
9. M.A. Mahtab, S. Rahman, M. Khan , F. Karim. Hepatitis B virus genotypes: an overview. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2008. 7: p. 457-464
10. B. J. McMahon. The influence of hepatitis B virus genotype and subgenotype on the natural history of chronic hepatitis B. Hepatol Int., 2009. 3: р. 334–342.
11. Mokrousov, O. Narvskaya, A. Vyazovaya, J. Millet, T. Otten, B. Vishnevsky and N. Rastogi Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype in Russia: in Search of Informative Variable-Number Tandem-Repeat Loci JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Nov. 2008, p. 3576–3584.
12. V.V. Nikolayevskyy, T. J. Brown, Y. I. Bazhora, A. A. Asmolov, Y. M. Balabanova and F.A. Drobniewski Molecular epidemiology and prevalence of mutations conferring rifampicin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis strains from the southern Ukraine Clin Microbiol Infect 2007; 13: 129–138
13. I. N. Okeke, K. P. Klugman, Z. A. Bhutta, A. G. Duse, Ph. Jenkins, T. F. O’Brien, A. Pablos-Mendez, R. Laxminarayan Antimicrobial resistance in developing countries. Part II: strategies for containment Lancet Infect Dis 2005; 5: 568–80
14. M. C. Raviglione The TB epidemic from 1992 to 2002 Tuberculosis (2003) 83, 4–14.
15. S. Schaefer. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol,  2007. 13: р. 14-21.
16. S. Schwúbel, C.S.B. Lambregts-van Weezenbeek, M-L. Moro, F. Drobniewski S.E. Hoffner, M.C. Raviglione, H.L. Rieder Standardization of antituberculosis drug resistancesurveillance in Europe Eur Respir J 2000; 16: 364-371.
17. T. Tallo, V. Tefanova, L. Priimagi, J. Schmidt, O. Katargina, M. Michailov, S. Mukomolov,L. Magnius, H. Norder. D2: major subgenotype of hepatitis B virus in Russia and the Baltic region. Journal of General Virology, 2008. 89: р. 1829–1839
18. O. S. Toungoussovaa, G. Bjuneb, D. A. Caugant Epidemic of tuberculosis in the former Soviet Union: Social and biological reasons Tuberculosis (2006) 86, 1–10.
19. B.Tsatsralt-Od, M. Takahashi, K. Endo, O. Buyankhuu, O. Baatarkhuu, T. Nishizawa, H. Okamoto. Infection with hepatitis A, B, C, and delta viruses among patients with acute hepatitis in Mongolia. J Med Virol, 2006. 78: р 542-50.
20. D. Vincenti, M. Solmone, A. R. Garbuglia, F. Iacomi, M. R. Capobianchi. A sensitive direct sequencing assay based on nested PCR for the detection of HBV polymerase and surface glycoprotein mutations. Journal of Virological Methods ,2009. 159: р. 53–57.