МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА, ИХ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА

Аннотация: Изучены различные методы выделения микобактерий туберкулеза у больных туберкулезом легких, находившихся на стационарном лечении  в   ОПТД. 

Ключевые слова: метод культивирования,  система   BACTEC  MGIT 960, среде Левенштейна-Йенсена, микобактерий туберкулеза..

«… нельзя забывать, что даже при очевидном, на первый взгляд, диагнозе существуют определенные обязательные исследования, данными которых врач должен располагать»

Обнаружение наиболее опасных источников туберкулезной инфекции среди пациентов, обратившихся в лечебное учреждение, а именно больных ТБ легких, в мокроте которых микобактерии определяются методом простой бактериоскопии, является главным компонентом борьбы с туберкулезом.   Кислотоустойчивая микобактерия (КУБ) в мазке, обнаруженная из образца, является основой предварительного диагноза микобактериальной инфекции, в то время как культуральное выделение микобактерий обеспечивает постановку точного диагноза туберкулеза или заболевания вызванного микобактериями. До 50-60% клинических образцов с положительной пробой могу не показать наличия КУБ в мазке. Следовательно, культуральные методы играют ключевую роль в диагностике микобактериальных инфекций. Для выращивания  микобактерий вот уже несколько десятков лет используются яичная питательная среда, например, среда Левенштейна — Йенсена или Огава.

«Золотой стандарт» или классический метод выявления микобактерий туберкулеза перестал удовлетворять запросы практического здравоохранения из-за длительности их культивирования, в течении 1-3 месяцев.   В 1969г. Деланд и Вагнер разработали методику полуавтоматического определения метаболизма бактерии путем измерения количества CO2, освободившегося в процессе роста, и декарбоксилирования субстрата класса С, выведенного в питательную среду.

Этот радиометрический способ широко применялся для гемокультур с использованием систем BACTEC 460 TB.В 1980г. данный метод был внедрен для выделения микобактерий из клинических образцов, а также для постановки тестов на лекарственную чувствительность. Одним из недостатков системы  BACTEC 460 TB является использование радиоактивного субстрата класса С. Из-за строгих требований к обработке и утилизации радиоактивных веществ, возникла необходимость в разработке методики без использования радиометрических технологий. Компания Becton g Dickinson (BD) разработала новую систему – индикаторную пробирку для выращивания микобактерий Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT), не использующую радиометрию, но обеспечивающую такие же –быстрые, точные и надежные методы тестирования, как и BACTEC 460 TB.

BACTEC MGIT 960 – полностью автоматизированная система для роста, детекции и тестов на лекарственную чувствительность М. tuberculosis, значительно сокращаются сроки исследований до 21 дня.  Содержимое пробирки MGIT – это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл. стирильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка BACTEC MGIT Growth Supplement OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза, каталаза). Она крайне важна для роста многих микобактерий.

 Для предотвращения контаминации необходимо добавить MGIT PANTA. Кроме жидкой среды Мидлбрук7Н9, в пробирке MGIT содержатся: бескислородный флюорохром, трис 4, 7-дифенил-1, 10-фенентролин пентагидрат хлорида рутения, помещенный на дно пробирки и покрытый силиконом. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода прекращается ингибирование флюорохрома.  

Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC MGIT 960.   Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста. Пробирка инкубируется при температуре 37*С с последующим мониторированием степени флюоресценции каждые 60 минут. В случае с М. tuberculosis в момент положительного посева пробы наблюдается около 105-106 колониеобразующих единиц (ЕОЕ) на 1мл. среды. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня).В основе теста на  лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза лежит модифицированный метод пропорций. В процессе определения происходит сравнение скорости роста  микобактерий туберкулеза — в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. Для проведения теста используются специальные держатели для 2,3,4,5,8 пробирок. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат- контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке.

Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным микобактериям, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флюоресцентности в данной пробирке будет выраженный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960, который автоматический интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности к препарату.  

В лаборатории Областного Противотуберкулезного диспансера с 2010 года параллельно «Золотому стандарту», посеву на плотных средах (Левенштейна –Йенсена), взят на вооружение новый метод выявления чистой культуры микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной устойчивости к  противотуберкулезным препаратам, на аппарате BACTEC MGIT 960.

Был проведен анализ результатов культурального исследования мокроты больных, которым МБТ в мокроте определяли несколькими методами:  посевом на плотной питательной среде Левинштейна-И-Йенсена и с использованием микробиологического анализатора BACTEC MGIT 960 (жидкая среда Мидлбрука).  Результаты исследования представлены в таблице №1.  

Таблица №1

Сравнительный анализ различных методов выявления  микобактерий туберкулеза в ОПТД г.Павлодара.

Анализ показал, что по частоте получения положительных результатов посевов между двумя исследованными методами была обнаружена статистическая разница; у 96,3% больных выявлены на среде Левенштейна –Йенсена, у 99,2% больных на жидкой среде. Помимо этого была получена разница и в сроках детекции МБТ на плотной питательной среде около 27 дней, на жидкой среде средний срок 8 дней. То есть, выявляемость микобактерий на жидкой питательной была выше, чем на плотной среде, при этом отмечалось сокращение сроков исследований.  

Выводы:

1. Применение системы BACTEC MGIT 960 для культивирования микобактерий туберкулеза по сравнению с плотной средой Левинштейна-Йенсена сократило сроки  получения результатов в 3 раза.

2. При использований системы BACTEC MGIT 960 в  получении положительных результатов по сравнению с посевом  на плотной питательной среде обнаружена разница, соответственно 99,2% и 96,3%.

Литература:

1. Агзамова Р.А., Белова Е.С., Бисмильда В.Л. идр. Культуральные методы выделения микобактерий туберкулеза и определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам 1- й линии. Методические рекомендации. Алматы. 2004г.
2. Руководство. По работе с Системой BACTEC MGIT 960. Salman H. Siddigi  (USA) Sabine Rusch- Gerdes ( Germany)