+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

ЛИНЕЙНЫЙ ИММУННЫЙ АНАЛИЗ (ЛИА) В ДИАГНОСТИКЕ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Автор: А.П. Масютина
Место работы: Директор по развитию бизнеса ТОО «Lex Trade»

Линейный иммунный анализ (LIA) — линейный непрямой иммуногический анализ для качественного измерения аутоантител класса IgG (и/или IgА).

Компания HUMAN GmbH., Германия производит несколько видов LIA-тестов для определения аутоантител:

  • LIA для определения антител при желудочно-кишечных заболеваниях IMTEC-Gastro-LIA,
  • LIA для определения антител при аутоиммунном миозите IMTEC-Myositis-LIA,
  • LIA для определения аутоантител при аутоиммунных заболеваниях печени IMTEC-Liver-LIA S,
  • LIA для определения антител при аутоиммунном васкулите IMTEC-Vasculitis-LIA,
  • LIA для определения антиядерных антител IMTEC-ANA-LIA (12 аутоантител),
  • LIA для определения антиядерных антител IMTEC-ANA-LIA Maxx (17 аутоантител).

Подробно рассмотрим ANA-LIA-Maxx, который представляет собой нитроцеллюлозную мембрану с 17 нанесенными антигенами для диагностики таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка, синдром Шегрена, склеродермия, синдром CREST, смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ), первичный билиарный цирроз, миозит. С данными заболеваниями могут быть связаны гломерулонефрит, РА, поражения ЦНС (психоз), анемия, лейкопения, нейтропения, легочный фиброз, неонатальная волчанка, инсульты, вызванные васкулитом.

Маркеры системной красной волчанки:

1. ds DNA (двуспиральная ДНК)

  • Антитела к ds DNA относятся к АЯА. С 1982 — один из 11 критериев системной красной волчанки (СКВ).
  • Обнаруживаются у 40-70% больных СКВ и указывают на активную фазу. Специфичность до 96%.
  • При успешном лечении титр снижается. Изменение концентрации позволяет предсказать рецидив заболевания.
  • Высокий риск развития волчаночного гломерулонефрита.
  • «Kлеточный фактор LE».

2. Nucleosome (нуклеосомы)

  • Антитела обнаруживаются у больных СКВ и ЛКВ.
  • Значительно раньше, чем к ds DNA – более чувствительный маркер.
  • У 84-88% больных СКВ, при этом у 16-30% больных СКВ с необразовавшимися еще антителами к ds DNA и к гистонам.
  • Редко при синдроме Шегрена и СЗСТ — 5-8%.
  • Развитие гломерулонефрита.

3. Histone (гистоны)

  • Гистоны — основной класс нуклеопротеинов, необходимых для сборки и упаковки нитей ДНК в хромосомы.
  • Антитела вырабатываются к димерам гистонов H2A и H2B.
  • Маркер для дифференциальной диагностики СКВ И ЛКВ: антитела обнаруживаются у 50-90% больных ЛКВ, при этом отсутствуют антитела к ds DNA.
  • При 20-50% случаев спонтанной СКВ.
  • Также можно обнаружить у больных первичным билиарным циррозом, РА, склеродермией, аутоиммунным гепатитом.

4. SmD1

  • Антиген Sm состоит из 9 различных полипептидов – белков snRNPs. Главная цель для антител — белок D1.
  • Высокоспецифичный маркер СКВ (94% специфичность) входит в критерии СКВ, принятые Американской ревматологической ассоциацией, и подтверждает диагноз СКВ.
  • Антитела обнаружены у 20-30% СКВ, часто в комбинации с антителами к U1-snRNP.
  • Уровень не отражает тяжесть заболевания.
  • Активная фаза заболевания, более агрессивное течение с поражением ЦНС и почек.

5. PCNA — proliferation cell nuclear antigen

  • Ядерный антиген пролиферирующих клеток — вспомогательный фактор ДНК-полимеразы во время репликации и репарации ДНК.
  • У 2-5% больных СКВ, но является важным клиническим маркером, так как наличие антител связанно с высокой частотой развития гломерулонефрита и тромбоцитопении.

6. P0 — ribosomal P phosphoproteins

  • Антитела к фосфоропротеинам рибосомального белка Р ингибируют взаимодействие факторов элонгации и рибосом, и также синтез белка в живых клетках.
  • Обнаруживаются у 10–20% больных СКВ.
  • При сильном поражении ЦНС – развитие волчаночного психоза.
  • Повышение концентрации антител коррелирует с эпизодами психоза.

Таким образом, маркеры системной красной волчанки:

  • Nucleosome – появляются значительно раньше, чем к ds DNA – более чувствительный маркер.
  • ds DNA — активная фаза, высокий риск развития волчаночного гломерулонефрита.
  • Histone — для дифференциальной диагностики СКВ И ЛКВ: обнаруживаются у 50-90% больных ЛКВ, при этом отсутствуют антитела к ds DNA.
  • SmD1 — активная фаза заболевания, более агрессивное течение, поражение ЦНС и почек.
  • P0 — при сильном поражении ЦНС – развитие волчаночного психоза.
  • PCNA — с высокой частотой развития гломерулонефрита и тромбоцитопении.

Маркеры синдрома Шегрена:

1. SS–A / Ro 60 kD и SS–A / Ro 52 kD

  • Антитела к антигену Ro/SS-A направлены на белки массой 52 кДа и 60 кДа, которые входят в состав сплайсосомы.
  • Антитела только к SS–A / Ro 60 kD обнаруживаются у больных СКВ (около 13%) с выраженной симптоматикой фотосенситивных кожных проявлений — «бабочка».
  • Антитела только к SS–A / Ro 52 kD обнаруживаются у больных первичным СШ.
  • Антитела к обоим протеинам образуются у больных СКВ и вторичном синдроме Шегрена.
  • Поражения легких, ЦНС, инсульты, вызванные васкулитом, почечная недостаточность.

2. SS–B / La

  • SS-B/La антиген является рибонуклеопротеином.
  • Более специфичный маркер СШ, на западе 50-60%, на востоке до 87%.
  • Обнаруживается у 10-15% больных СКВ и вторичным СШ.
  • В основном проявляется в комбинации с антителами к SS–A/ Ro 52 kD, что может прогнозировать развитие васкулита, лимфоаденопатии, спленомегалии, анемии и лейкопении.
  • Ассоциируется с низкой частотой развития нефрита.
  • При длительном заболевании СКВ во время активной фазы у 50-60% больных антитела к SS–В способствуют развитию нейтропении.
  • Антитела к dsDNA и белкам Р также могут способствовать нейтропении.

Маркеры склеродермии:

1. CENP-B — Centromere protein B

  • CENP-B — это ДНК-связывающий белок, который играет основную роль при формирование центромеры.
  • Антитела к CENP-B антигену разрушают организацию кинетохоров и вмешиваются в движение хромосом, этим останавливая деление клеток.
  • Высокоспецифичный маркер CREST-синдрома и лимитированной склеродермии: у 80-90% больных CREST были обнаружены антитела к CENP-B, в то время как у людей с ревматоидными болезнями, не имеющими отношения к CREST, анализ на антитела был отрицательным.

Антитела прогнозируют типичные проявления синдрома СREST, такие как:

  • Синдром Рейна с поражением пальцев и лица и только через длительное время (до 10 лет) — поражение внутренних органов.
  • Также наблюдается лимитированное поражение кожи и низкая вероятность развития легочного фиброза.

2. Scl-70 (scleroderma 70 kD)

  • Антитела к ДНК-топоизомеразе I, которая разрешает топологические проблемы, связанные со сверхспирализацией ДНК.
  • Показатель диффузной и прогрессирующей системной склеродермии, специфичность 90-100%.
  • Связаны с более усложненной формой заболевания.
  • У больных с антителами к Scl-70 наблюдается низкий уровень выживания с ранними и летальными поражениями почек и сердца.

Смешанное заболевание соединительной ткани:

1. U1-snRNP (small nuclear ribonucleoprotein complex)

  • U1 – один из 5 доменов сплайсосомы, около 70 кДа.
  • U1-snRNP необходим для сплайсинга мРНК и протекции транскриптома.

Если обнаружены антитела:

  • Только к U1-snRNP и отрицательно к SmD1 – указывает на СЗСТ, с классическими клиническими проявлениями заболевания (синдром Рейна, артрит, акросклероз, отек рук, миозит и легочная гипертензия).
  • И к U1-snRNP, и к SmD1 (или другие антитела СКВ) – классический СЗСТ разовьется в СКВ. Маркер нефрита, существующего или развивающегося. У 30-40% больных СКВ антитела образуются задолго до клинического проявления.
  • К U1-snRNP и PM-Scl — перекрестный синдром: системная склеродерма и ДМ/СКВ/СШ.
  • Сильная корреляция с болезнью легких и гломерулонефритом.

Первичный билиарный цирроз:

1. AMA M2 (anti-mitochondrial antibodies)

  • Митохондриальный антиген M2 является частью пируватдегидрогеназного комплекса, подготавливающий Ацетил-КоА для цикла трикарбоновых кислот (Кребса).
  • Находится на внутренней митохондриальной мембране и матриксе.
  • Высокоспецифичный маркер (90 — 95%) первичного билиарного цирроза.
  • У больных ПБЦ активированные Т-лимфоциты атакуют и разрушают эпителиальные клетки мелких желчных протоков, где экспрессия гена M2 происходит в больших количествах.
  • Из-за поврежденных желчных протоков происходит застой желчи в печени (холестаз), что приводит к рубцеванию, фиброзу, циррозу и печеночной недостаточности.
  • Высокий уровень ГГТ (GGT) подтверждает диагноз.

Миозит:

1. Jo-1

  • Маркер миозита и интерстициального заболевания легких.
  • Антитела к Jo-1 обнаружены у 33% больных с первичным полимиозитом и у 25% с первичным дерматомиозитом.
  • Часто при отсутствии основных ANA.
  • Высока вероятность развития полимиозита в хроническую и деформирующую форму заболевания.
  • Повышение уровня креатинкиназы подтверждает диагностику.
  • Анти-Jo-1-антитела направлены на гистидин–тРНК–синтетазу.
  • Признаки «Синдрома антисинтетазы» — синдром Рейна, полиартралгия или полиартрит, а также одышка.
  • Клетки легких особо обогащены этим ферментом, который локализируется в альвеолярном эпителии. Эти клетки — изначальные мишени для анти-Jo-1- антител, в то время как мышцы поражаются в более поздние стадии заболевания.

2. PM-Scl (polymyositis – scleroderma)

  • PM-Scl – комплекс из 10 ядрышковых антигенов – части комплекса РНК-экзосомы.
  • РНК-экзосома участвует в надлежащем развитии стабильных видов РНК и уничтожении побочных продуктов (некодирующие регионы, транскрипты с дефектами).
  • Высокоспецифичный маркер перекрестного синдрома склеродермии — полимиозита (ДМ).
  • Также, но реже, — маркер системной склеродермии.
  • Пациенты с анти -PM-Scl-антителами страдают язвами на подушечках пальцев и надкостными выступами, контрактурами суставов и атрофией мышц.
  • 55% пациентов также имеют фиброз легких и рестриктивный легочный процесс. Наблюдается значительное повышение креатинкиназы, но очень редко поражение желудочно-кишечного тракта и почек.

3. Mi-2 (β)

  • Mi-2-антиген является компонентом нуклеосом ремоделинг деацетилазы.
  • Антитела к Mi-2-антигену — серологический признак идиопатической воспалительной миопатии.
  • Специфичность более 96%. Антитела к Mi-2 находят у 10-15% больных с острым дерматомиозитом.
  • Клинические проявления: артралгия, синдром Рейна, артрит, интерстициальное заболевание легких, но не сердечная недостаточность.
  • При наличии антител к Mi-2 (β) высока вероятность развития злокачественного поражения, вызванного дерматомиозитом, и в дальнейшем рака (яичников, легких, поджелудочной железы, желудка, колоректального, лимфома нон-Ходжкин).

4. Ku

  • Ku-антиген – регулирующий компонент протеинкиназы, связанной с ДНК, которая фосфорилирует ДНК-полимеразу II и некоторые транскрипционные факторы.
  • Белки Ku важны для транскрипции гена U1-snRNP.
  • Ku-антитела содействуют развитию множественных аутоиммунных состояний. Антитела к Ku обнаружены у 5-25% пациентов с перекрестным синдромом склеродермии – полимиозитом.
  • Около 7% больных миозитом.
  • Также антитела к Ku образуются при легочной гипертензии на фоне склеродермии, при СКВ и первичном СШ.
  • Клинические проявления: артралгия, миозит, синдром Рейна.
  • Антитела к Ku не связанны с развитием рака при дерматомиозите.
  • Часто проявляются вместе с основными ANA (анти-Ro/SS-A, U1-snRNP).

Интерпретация ЛИА-тестов проводится с помощью входящего в набор прозрачного оценочного шаблона и исключительно на основе соответствующего cut-off-контроля, учитываемого для каждого стрипа (24 стрипа в наборе). Результат теста отрицательный, если ни одна из полос не распознана или если полоса демонстрирует меньшую интенсивность по сравнению с cut-off-контролем. Тест сомнительный, если интенсивность полосы и интенсивность cut-off-контроля сильно не отличаются. Результат теста положительный, если полоса демонстрирует более сильное окрашивание по сравнению с cut-off-контролем. Соответствующие результаты теста записываются в оценочный лист. Метод бесприборный, но для автоматизации метода, объективной оценки результатов, архивирования данных может быть использовано специализированное программное обеспечение HumaScan и сканер планшетного типа с минимальным разрешением 300 точек на дюйм.

Таким образом, представленные ЛИА-тесты могут использоваться для скрининга и ранней диагностики аутоиммунных заболеваний.

Литература

  1. Min D.J., Kim S.J., Park S.H., Seo Y.I., Kang H.J., Kim W.U., Cho C.S., & Kim H.Y. Anti-nucleosome antibody: significance in lupus patients lacking anti-double-stranded DNA antibody// Clin. Exp. Rheumatol. – 2002. — Jan-Feb. -20 (1):13-8.
  2. Rubin R.L., McNally E.M., Nusinow S.R., Robinson C.A. & Tan E.M. IgG antibodies to the histone complex H2A-H2B characterize procainamide-induced lupus// Clin. Immunol. Immunopathol. – 1985. – Jul. 36 (1):49-59.
  3. Migliorini P., Baldini C., Rocchi V. & Bombardieri S. Anti-Sm and anti-RNP antibodies // Autoimmunity. – 2005. – Feb. 38 (1):47-54.
  4. Asero R., Origgi L., Crespi S., Bertetti E., D’Agostino P. & Riboldi P. Autoantibody to proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in SLE: a clinical and serological study// Clin. Exp. Rheumatol.- 1987. — Jul-Sep. — 5 (3):241-6.
  5. Yamanaka K. & Takasaki Y. Anti-PCNA antibody// Rinsho Byori. – 1993. –Aug. — 41 (8):888-96.
  6. Stafford H.A., Anderson C.J., Blalock D.B., Reichlin M. Development of the anti-ribosomal P autoantibody response // Clin. Exp. Rheumatol. – 1998. — Mar-Apr. — 16 (2):119-24.
  7. M. Reichlin. Ribosomal P antibodies and CNS lupus// Lupus. – December. – 2003. — 12: 916-918.
  8. Bruner B.F., Wynn D.M., Reichlin M., Harley J.B. & James J.A. Humoral antigenic targets of the ribosomal P0 lupus autoantigen are not limited to the carboxyl region // Ann N Y Acad Sci.- 2005. – Jun. — 1051:390-403.
  9. Belfiore N., Rossi S., Bobbio-Pallavicini F., Epis O., Caporali R. & Montecucco C. Anti-Ro(SS-A) 52 kDa and 60 kDa specificities in undifferentiated connective tissue disease// Joint Bone Spine. – 2000. — 67 (3):183-7.
  10. Simmons-O’Brien E., Chen S., Watson R., Antoni C., Petri M., Hochberg M., Stevens M.B. & Provost T.T. One hundred anti-Ro (SS-A) antibody positive patients: a 10-year follow-up// Medicine (Baltimore). – 1995. – May. — 74 (3):109-30.
  11. Fritsch C., Hoebeke J., Dali H., Ricchiuti V., Isenberg D.A., Meyer O. & Muller S. 52-kDa Ro/SSA epitopes preferentially recognized by antibodies from mothers of children with neonatal lupus and congenital heart block// Arthritis Research & Therapy. – 2006. — 8 :R4
  12. P. Bini, J.L. Chu, C. Okolo & K. Elkon. Analysis of autoantibodies to recombinant La (SS-B) peptides in systemic lupus erythematosus and primary Sjogren’s syndrome. //J Clin Invest. – 1990. – February. — 85 (2): 325–333.
  13. S.C. Hsieh, H.S. Yu, W.W. Lin, K.H. Sun, C.Y. Tsai, D. F. Huang, Y.Y. Tsai & C.L. Yu. Anti-SSB/La is one of the antineutrophil autoantibodies responsible for neutropenia and functional impairment of polymorphonuclear neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus// Clin. Exp. Immunol.- 2003. – March. — 131 (3): 506–516.
  14. Russo K., Hoch S., Dima C., Varga J. & Teodorescu M. Circulating anticentromere CENP-A and CENP-B antibodies in patients with diffuse and limited systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis// J Rheumatol. – 2000. – Jan. — 27 (1):142-8.
  15. Wordeman L., Earnshaw W.C. & Bernat R.L. Disruption of CENP antigen function perturbs dynein anchoring to the mitotic kinetochore// Chromosoma. – 1996. — Jun. — 104 (8) — :551-60.
  16. Grassegger A., Pohla-Gubo G., Frauscher M, & Hintner H. (2008). Autoantibodies in systemic sclerosis (scleroderma): clues for clinical evaluation, prognosis and pathogenesis// Wien Med Wochenschr. – 2008. — 158 (1-2):19-28.
  17. Hanke K., Dähnrich C., Brückner CS., Huscher D., Becker M., Jansen A., Meyer W., Egerer K., Hiepe F., Burmester G.R., Schlumberger W. & Riemekasten G. Diagnostic value of anti-topoisomerase I antibodies in a large monocentric cohort// Arthritis Research & Therapy. – 2009. — 11:R28