+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

Внедрение иммунноцитохимии в диагностику опухолей молочной железы

Автор: Ж. Б. Елеубаева
Место работы: Центральная цитологическая лаборатория ТОО «Оздоровительный центр Масимова», лаборатория патоморфологии, цитологии и молекулярной патологии КазНИИОиР

РЕЗЮМЕ
В работе приводятся предварительные данные иммунноцитохимических исследований. Результаты определения уровня рецепторов гормонов эстрогена, прогестерона, индекса пролиферативной активности и определения факторов прогноза показали высокую чувствительность и специфичность. ИЦХ-исследование является высокоэффективным уточняющим диагностическим методом также и при цитологическом исследовании, и может быть использован при анализе гормонального статуса злокачественных образований молочной железы, определении факторов прогноза опухолей, для проведения уточняющей диагностики недифференцированных новообразований и для оценки степени распространенности опухолевого процесса.
Актуальность
Современная диагностика опухолей сопряжена не только с определением гистологического варианта и степени дифференцировки новообразования, но также связана с определением прогноза болезни и возможного ответа на терапию. В этом отношении чрезвычайно важны иммунногистохимические и молекулярно-генетические профили рака [1]. Благодаря успехам молекулярной биологии стали известны многие ключевые звенья канцерогенеза. На основе этих данных создан новый класс препаратов для лечения онкологических заболеваний, имеющих точную мишень воздействия. По данным Герштейна Е.С., Кушлинского Н.Е для применения таргетной терапии требуется установить наличие такой мишени в каждой конкретной опухоли [2]. 

Одним из первых таких препаратов стал блокатор эпидермального фактора роста (ЭФР) второго типа (Her 2) – белок р-185 – трансмембранный белок, член семейства рецепторов ЭФР Еrb 2 (герцептин) [3]. От активации с-erB-2 зависит прогрессия РМЖ, что находит отражение в более быстром и частом возникновении рецидива, развитии метастазов и неблагоприятном исходе заболевания [4]. Bcl 2 является ведущим геном, определяющим механизм клеточной смерти, подавляя апоптоз. Этот ген кодирует образование белка, накапливающегося в митохондриях, что при ИЦХ реакции находит отражение в пятнистой окраске цитоплазмы. Интенсивность реакции и ее распространенность коррелирует с наличием рецепторов эстрогена и низкой степенью гистологической злокачественности. По данным Волченко Н.Н., экспрессия Bcl 2 связана с факторами, указывающими на благоприятный прогноз [5]. 

Р53 является опухолевым геном супрессором, белковый продукт которого представляет собой ядерный транскрипционный фактор со многими функциями, включая блокирование прохождения клеток по митотическому циклу и индукцию апоптоза. Мутация р53, очень часто встречающаяся в опухолях, приводит к синтезу белка с потерей его функций, но обладающего высокой стабильностью и накапливающегося в ядре, что ИЦХ выражается в отчетливом ядерном окрашивании. Мутированный р53 является фактором плохого прогноза и неэффективности адъювантной терапии при самых разнообразных новообразованиях [6]. 

Рецепторы гормонов Э и П играют выраженную роль в предсказании эффективности эндокринной терапии РМЖ. При РЭ+ и РП+ непосредственное положительные результаты лечения получены у 70% больных, а 5-летняя безрецидивная выживаемость возросла на 20-30%. В случаях РЭ- и РП- не удалось добиться положительных результатов соответственно в 85 и 90% наблюдений. РП являются надежным прогностическим маркером [7,8]. 

ИГХ-исследование, широко применяемое в клинической практике, имеет ряд недостатков, среди которых основными являются потеря, маскировка антигена и длительное приготовление препаратов. В качестве альтернативы приобретает метод определения экспрессии молекулярных маркеров на клеточном уровне – иммуноцитохимический (ИЦХ) [9]. Пункционная биопсия – простая, малотравматичная процедура, – позволяет получить достаточное количество клеточного материала для ИЦХ-исследования. Иммуноцитохимия не требует больших временных затрат, выполняется быстро, в течение 2-3 ч. Мембранные и цитоплазматические маркеры окрашиваются положительно чаще, чем в гистологических препаратах. Возможно, это связано с более щадящей обработкой цитопрепаратов, отсутствием потери и маскировки антигенов при проводке и депарафинизации материала с использованием агрессивных химических реагентов, что негативно сказывается на мембранных и цитоплазматических рецепторах [9,10].
Цель исследования
Определение возможностей ИЦХ-исследований при диагностике рака молочной железы.

Материалы и методы
Нами были исследованы 34 женщины, лечившиеся в КазНИИОиР, с клиническим диагнозом рак молочной железы. Возраст женщин колебался от 24 до 63 лет. Изучены показатели экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, пролиферативная активность онкопротеина, а также факторы прогноза, роста, индукции апоптоза методом ИЦХ-исследований. Были использованы соответствующие маркеры для определения Ki 67, с-erВ 2 , Bсl-2, р53, РЭ, РП и красители (Гематоксилин Джилла). Препараты готовились с помощью цитоцентрифуги, в виде тонкослойного и локального распределения материала. Клеточный субстрат помещали в специальную белковую питательную среду в виде клеточной взвеси, что позволило сохранить морфологические, биохимические, биологические и иммуноспецифические свойства. Это также способствовало более длительному хранению материала при температуре +4° и использованию его повторно.

Результаты
Анализ нашего исследования показал, что положительные результаты рецепторов эстрогена были 87%, прогестерона – 69%; в 86% позитивными были исследования на c-erB 2, а пролиферативная активность Ki 67 соответствовала 94%, показатель p53 составлял 55%, Bcl 2-86% (таблица 1). 
Таблица 1. Результаты ИЦХ-исследований в абсолютных и процентных отношениях

Внедрение иммунноцитохимии в диагностику опухолей молочной железы

Как видно из таблицы, в 5 случаях рецепторы эстрогена, а в 12 случаях рецепторы прогестерона, были негативными, что, очевидно, связано с менопаузальным статусом обследуемых женщин. Отсутствие экспрессии с-erВ 2 в 8 случаях, Bcl 2 в 3 случаях и р53 в 9 случаях в цитологическом материале совпали с гистологическим показателями. 

Сопоставление результатов ИГХ и ИЦХ показателей свидетельствуют, что использованные маркеры являются чувствительными, специфичными и вполне адекватными при диагностике и дальнейшей терапии рака молочной железы. Предварительные данные по внедрению метода иммунноцитохимии в клинической практике лаборатории цитологии КазНИИОиР вполне сопоставимы с данными литературы [5,6,7,8]. 

Таким образом, метод иммуноцитохимии является эффективным и уточняющим диагностическим тестом при цитоморфологической диагностике РМЖ; может быть рекомендован для широкого применения при определении гормонального статуса, пролиферативной активности, факторов прогноза при различных вариантах рака молочной железы.

Литература:
1. Введение в молекулярную диагностику//под ред. М.А.Пальцева. – М., – 2010. – с. 1-2
2. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы// Практическая онкология. – 2002. – Т.3, №1. – с. 38-44
3. Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Морфологическое исследование Her2 статуса при раке молочной железы. – М., – 2010
4. Волченко Н.Н., Савостикова М.В. Атлас цитологической и иммуноцитохимической диагностики опухолей. – Москва, Репроцентр, – 2010
5. Волченко Н.Н., Савостикова М.В. Возможности ИЦХ исследования в предоперационной диагностике опухолей// Российский онкологический журнал. – 2006. – №5. – с. 22-27
6. Пожарисский К.М. Прогностические и предсказательные значение ИГХ маркеров при онкологических заболеваниях. – 2004
7. Allred et all. // Journal of… Food, Nutrition, Physical Activity and the Prevention of Cancer: Global Perspective: A Launch Conference, November 6-7, 2008, Washington
8. Cooper L.S., Gillett C.E., Patel N.K. et al. Survival premenopausal breast carcinoma patients in relation to menstrual cycle timing of surgery and estrogen receptor. Cytopathol 1999; 21(5):351-4
9. Глухова Е.И. Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, при раке молочной железы. Автореф. дис. канд. мед. наук. – М., – 2003
10. Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорная В.А., Крячок И.А. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. – Киев, Морион; – 2003. – с. 28-31.