ЦИТОКИНЫ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ БИОМАРКЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ ВНУТРИУТРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ И РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ У ЖЕНЩИН С ВНУТРИУТРОБНОЙ ГИБЕЛЬЮ ПЛОДА

Аннотация

Представлены результаты этиологической расшифровки перинатальных потерь в I и во II триместрах беременности в Омской области. Наряду с важной ролью Staphylococcus aureus и Escherihia coli показана патогенетическая значимость Epstein-Barr virus (ДНК детектирована у 33% эмбрионов/плодов) и Parvovirus В19. Поиск потенциальных биомаркеров развития осложнений доказал возможность использования ИЛ-10 и РАИЛ в качестве прогностических критериев. Динамика уровня цитокинов в первые сутки послеабортного периода выявила у пациенток с ССВР повышение уровня ИЛ-10 в 96,0 раз, а у женщин с гнойно-воспалительными процессами плодного яйца и/или децидуальной ткани – увеличение РАИЛ (в 1,7 раза) и лактоферрина (в 1,4 раза). При благоприятном течении на третьи сутки после элиминации эмбриона/плода содержание ИЛ-10 и РАИЛ не отличалось от показателей контрольной группы, а уровень ИЛ-6 был снижен в 3,2 раза.

Ключевые слова: цитокины, гибель плода, инфекции, беременность, Staphylococcus aureus, Escherihia coli, Epstein-Barr virus,Parvovirus В19, прогноз.

1. Введение

Проблема перинатальных инфекций имеет важное медико-социальное значение (1, 7, 9, 11). Реализация инфекции в период беременности может приводить к преждевременному прерыванию беременности, внутриутробной гибели эмбриона/плода, формированию пороков развития, мертворождению, влиять на состояние здоровье детей, показатели младенческой заболеваемости и смертности (1, 6, 11). Эта проблема также привлекает внимание исследователей с целью этиологической расшифровки и установления факторов риска, диагностических и прогностических критериев развития осложнений во время беременности, родов и в послеродовом периоде (3, 5, 8, 10, 12, 20).

По литературным данным частота внутриутробной инфекции колеблется от 2 до 65,5% (1, 9, 11, 20), а частота неразвивающейся беременности на ранних сроках составляет 24,5 — 28,6% (5, 7, 10), при этом выявлена тенденция к увеличению вклада вирусной инфекции в формирование патологии плода и в генез неразвивающейся беременности (3, 7, 11, 13) с доказанной ролью герпесвирусов (1)и парвовируса (Parvovirus B19 — PV B19) (18). Среди вирусов семейства Herpes viridae потенциальными патогенами признаны Cytomegalovirus  (CMV) (14, 17) иHerpessimplexvirus 1 и 2 типов (HSV–1/2) (16, 19). В последние годы обсуждается значимость Epstein-Barr virus (EBV) в индуцировании перинатальной патологии (3, 13, 15).

Результаты эпидемиологических исследований по перинатальной патологии в г. Омске (2001-2010 годы) показали рост внутриутробных инфекций, увеличение в течение последних 5 лет частоты неразвивающихся беременностей (с 7,3 до 8,8 на 100 родов), а также высокая патогенетическая значимость, как бактериальной микрофлоры, так и вирусов (CMV, HSV-1/2, EBV, PV B19, Rotavirus) (3).

Гибель эмбриона или плода, его длительная задержка в полости матки могут привести к развитию осложнений (эндометрит, синдром системной воспалительной реакции – ССВР), что ухудшает прогноз последующих беременностей, создает угрозу не только здоровью, но и жизни женщины (5, 7, 10).В последние годы, в поисках критериев развития инфекции в перинатальном периоде, вектор исследований направлен на изучение иммунорезистентности и цитокинового профиля при физиологической и патологической беременности (6, 8, 12).Как известно, в ответ на воздействие инфекционного фактора, цитокины появляются первыми в каскаде воспалительных реакций и определяют дальнейшее течение процесса посредством вовлечения в него фагоцитирующий и цитолитических клеток с их последующей активацией (4). В связи с этим, представляет определенный научный интерес изучение возможности использования отдельных цитокинов в качестве биомаркеров реализации инфекции и развития осложнений у женщин при оказании неотложной помощи, связанной с элиминацией погибшего плода (эмбриона), на прегравидарном этапе и при последующей беременности.

Целью исследования: этиологическая расшифровка перинатальных потерь и разработка критериев развития осложнений у женщин с внутриутробной гибелью плода для оптимизации диагностики, лечения и последующей прегравидарной подготовки.

2.Материалы и методы

Проведено двухэтапное открытое когортное, проспективное, контролируемое исследование. На I этапе работы в исследование были включены 189 пациенток с подтвержденной гибелью эмбриона/плода (основная группа — А), в том числе: 119 женщин с несостоявшимся выкидышем в I триместре (средний возраст 28,0±0,6 лет; подгруппа А₁) и 70 женщин – во II триместре беременности (средний возраст 29,0±0,7 лет; подгруппа А₂). Срок беременности на момент госпитализации был в группе А₁ 8,4±0,2 нед., в группе А₂ – 19,7±0,4. В качестве контроля были обследованы 20 небеременных условно здоровых женщин (группа В). Группой сравнения (группа С) служили 25 женщин с физиологически протекающей беременностью. На II этапе проводилось выявление причинно-следственных связей у 105 женщин (средний возраст 32,0±0,9 лет), перенесших неразвивающуюся беременность, с последующей прегравидарной подготовкой и клинико-лабораторным мониторингом течения настоящей беременности.

Основным материалом для исследования служили: кровь; забранные в стерильных условиях соскобы и отделяемое из полости матки; ткани элиминированных эмбрионов/плодов. Этиологическая расшифровка базировалась на результатах полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленной на выявление ДНК потенциальных возбудителей: Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, CMV, HSV-1 и 2, EBV, PV B19, Rotavirus, Listeria monocytogenes, Toxoplasma gondii) на наборах «АмплиСенс» (производство ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва), иммуноферментного анализа — ИФА (выявление специфических антител – при необходимости) и микробиологических исследований (тест-системы «Genital sistem®» и «Vagicult®» производства компании «Liofilchem», Италия). Уровень лактоферрина (острофазовый белок) и цитокинов (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-1β и растворимого антагониста IL-1β – IL-1β-Ra) оценивали в ИФА (тест-системы «РгоСоn» компании «Протеиновый контур», г. Санкт-Петербург; ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская обл.). Поскольку герпесвирусная инфекция способна путем секреции цитокинов приводить к «переключению» антикоагулянтных свойств эндотелия на прокоагулянтные, а персистенция герпесвирусов на фоне тромбофилии обусловливает взаимное усиление негативного влияния на систему гемостаза с реализацией основных гестационных осложнений, то параллельно методом ПЦР проводились исследования для выявления полиморфизмов генов системы гемостаза (набор реагентов компании «Литех»; г. Москва). 

Статистическая обработкаосуществлялась с помощью программы «Статистический анализ клинико-лабораторных данных для прогнозирования риска развития патологии (R-med)» (Свидетельство о регистрации программы для ЭВМ № 2011614225) и программы «STATISTIKA-6» с использованием параметрических и непараметрических методов: χ²,метод углового преобразования Фишера (Pφ), критерий Манна-Уитни (U). Корреляционные взаимосвязи устанавливались при расчете коэффициента Пирсона (r). Различия величин признавали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

3. Результаты и их обсуждение

Анализ данных, полученных на I этапе работы, показал следующее. Микробиологический профиль в основной группе отличается колонизацией биотопа влагалища различными представителями бактерий условно-патогенной группы, факультативными анаэробами, угнетением молочно-кислых бактерий, наличием вирусов. При исследовании влагалищного секрета установлено, что нормобиоценоз был у 73 (62,9%), бактериальный вагинит – у 30 (25,9%), вульвовагинальный кандидоз – у 13 (11,2%) женщин. Микст-инфекция выявлена в 31,5%, моноинфекция – в 48,3%. В 20,2 % рост бактерий отсутствовал. Инфицирование полости матки выявлялось в 79,8±4,1% (р=0,001), в 42 (из 61, χ2=5,87, р=0,015) преобладала кокковая микрофлора (St. epidermidis, St. aureus, Enterococcus faecalis), а в 21 (из 28, χ2=4,80, р=0,029) — Ur. urealyticum. В 63,9±4,0% случаев эмбрионы и плоды были инфицированными (р=0,018), при этом в обоих триместрах беременности EBV был выявлен в 33,3±5,7%. В I триместре беременности наиболее часто выявлялась Ur. urealyticum (46 из 63, χ2=9,11, p=0,003), во II триместре – Listeria (χ2=4,17, p=0,041) и T. gondii (χ2=5,96, p=0,015).

Среди женщин с замершей беременностью в I триместре ССВР-I был диагностирован у 27 (23,5%), ССВР-II — у 7 (6,1%) больных. Во II триместре ССВР развивался чаще, чем в I триместре: из 42 пациенток ССВР-I выявлен у 15 (35,7%), ССВР-II – у 5 (11,9%). При оценке цитокинового профиля у женщин с физиологически протекающей беременностью (группа С) установлено снижение уровня цитокинов с функцией медиаторов воспаления по сравнению с данными группы контроля: IL-6 – на 39,4% (р=0,021), TNF-α – на 66,5% (р=0,001). Было выявлено снижение уровня IL-10 на 94,6% (р=0,007), IL-1β-Ra – на 93,3 %, (р=0,001) и лактоферрина на – 50,4%, р=0,009 (табл. 1). В случае развития ССВР наблюдалось увеличение уровня провоспалительного цитокина TNF-α и противовоспалительного IL-1β-Ra, а у больных без ССВР дополнительно был повышен уровень IL-10 в сравнении с данными при физиологически беременности (табл. 2). Установлено, что снижение уровня IL-10 в группах А₁ и А₂ опережало развитие известных клинико-лабораторных признаков ССВР (р=0,008), что подтверждено наличием обратной сильной корреляционной связью между ССВР и IL-10 (r_s=-0,7; р=0,018). Гибель плода (независимо от срока гестации и развития ССВР) сопровождалась снижением уровня IL-1β-Ra и лактоферрина по сравнению с контролем (табл. 3). Определение содержания цитокинов в динамике в первые сутки послеабортного периода выявило у пациенток с ССВР статистически значимое повышение уровня IL-10 (в 96,0 раз), IL-1β-Ra (в 1,7 раза) и лактоферрина (в 1,4 раза) в сравнении с данными при поступлении. На третьи сутки после элиминации эмбриона/плода на фоне проведения адекватной терапии (в зависимости от верифицированной инфекции) клинико-лабораторные проявления ССВР отсутствовали у всех пациенток, а содержание цитокинов не отличалось от показателей контрольной группы. Исключение составил ИЛ-6, уровень которого был снижен в 3,2 раза по сравнению с контролем (табл. 3). Также установлено, что в группе пациенток с гистологически верифицированным эндометритом содержание IL-1β-Ra в первые сутки после аборта увеличивалась в 4,3 раза (р=0,004) в сравнении с периодом при поступлении и в 3,3 раза (р=0,008) в сравнении с данными пациенток без гнойно-воспалительных изменений плодного яйца и/или децидуальной ткани.

Результаты исследований, выполненных на II этапе, доказали, что EBV способен индуцировать гибель плода, особенно в случае носительства мутантных аллелей генов иммунного ответа (159 C/T в гене CD14, Arg753Gln и Gln753Gln в гене TLR2, С589Т в гене IL-4), что подтверждено наличием положительных ассоциативных связей (r=0,82, p=0,001). В 7,6% случаев наряду с ДНК EBV параллельно была выделена ДНК CMV, в 24,1% случаев – ДНК HSV-1 и 2 типа, что свидетельствует о том, что EBV-инфекция нередко протекает в виде смешанной инфекции и приводит к более тяжелому течению инфекционного процесса (r=0,73, p=0,01). При этом факторами риска развития внутриутробной инфекции, сопряженной с герпесвирусными инфекциями, являются: перенесенный инфекционный мононуклеоз (р=0,01), рецидивирующие во время беременности воспалительные заболевания верхних дыхательных путей (р=0,02), кольпит (р=0,001), бактериальный вагиноз (р=0,001), гепатит и гепатоспленомегалия (р=0,003). Реализация герпесвирусной инфекции проявляется: угрозой прерывания беременности (р=0,005), задержкой развития плода (р=0,04), хронической плацентарной недостаточностью (р=0,003), многоводием (р=0,02), кальцинатами плаценты (р=0,02). Для прогноза риска важное значение имеет выявление ДНК EBV (р=0,007). В случае реализации внутриутробной инфекции выявлен повышенный синтез IL-1β, (538,27±6,5 пг/мл; р=0,002), TNF-α (88,27±0,8 пг/мл; р=0,04), IL-8 (73,45±0,5 пг/мл; р=0,005) и IL-6 (21,06±1,2 пг/мл; р=0,008), свидетельствующий об активации макрофагального звена иммунной системы. Вместе с тем, выявлена тенденция к снижению провоспалительного цитокина IL–10 до уровня 0,52 (в 13 раз; р=0,001) по сравнению с группой женщин с физиологической беременностью, что указывает на его ингибирующую роль в воспалительной реакции.

Практическое использование полученных результатов позволили снизить количество органоуносящих операций в 5 раз и предотвратить материнскую смертность в условиях стационара, а последующая прегравидарная подготовка улучшила исходы беременности: преждевременное прерывание беременности снизилось до 18,7% (в 3,7 раза) и антенатальная гибель плода — до 0,8%.

4. Заключение

Таким образом, проведенные исследования показали, что в случае гибели плода и при наличии инфекционно-воспалительного процесса в полости матки существует высокий риск развития осложнения (эндометрит, ССВР). В качестве биомаркеров реализации внутриутробной инфекции и развития осложнения могут выступать цитокины. Наибольшее значение для оценки риска развития ССВР имеет содержание ИЛ-10, динамика которого опережала известные клинико-лабораторные показатели ССВР у женщин с внутриутробной гибелью плода. Установление причинно-следственных связей показало важное патогенетическое значение EBV, который нередко ассоциирует с другими герпесвирусами. Реализация внутриутробной инфекции сопряжена с полиморфизмами генов системы гемостаза и сопровождается нарушением цитокиновой регуляции.

Таблица 1

Концентрация цитокинов в сыворотке крови у здоровых небеременных женщин (В) и при физиологической беременности (С),

Медиана (нижний квартиль; верхний квартиль)

Примечание: статистически значимые различия в сравнении с группой В *– р<0,05; **– р <0,01; **– р<0,001

Таблица 2

Концентрация цитокинов в сыворотке крови при физиологической (С) и неразвивающейся беременности (А₁ и А₂) до начала лечения

Медиана (нижний квартиль; верхний квартиль)

Примечание: различия достоверны в сравнении с группой С *– р <0,01

Таблица 3

Концентрация цитокинов у здоровых небеременных женщин (контроль) и пациенток с несостоявшимся выкидышем, Медиана (нижний квартиль; верхний квартиль)

Примечание: статистически значимые различия показателей цитокинового профиля в сравнении с контролем * – р<0,05; ** – р<0,01; *** – р<0,001

Литература:

1. Буданов П.В., Стрижаков А.Н. Этиология, патогенез, диагностика и лечение внутриутробной инфекции. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2010. – Т. 9. № 3. – С. 61-71.
2. Гервазиева В.Б., Самойликов П.В.Взаимодействие вирусов семейства Herpesviridae c иммунной системой человека // Аллергология и иммунология. – 2010. – Т. 11,  № 1. – С. 31 – 41.
3. Долгих Т.И., Мироненко М.М., Шелев М.В. Этиологическая характеристика инфекционных заболеваний перинатального периода в Омской области // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2011. – № 2. – С. 8-12.
4. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. – СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2008. – 552 с.
5. Кулавский В.А., Сыртланов И. Оптимизация ведения женщин, перенесших неразвивающуюся беременность // Академия Безен. – 2009. – № 4. – С. 19-21
6. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и др. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – 176 с.
7. Несяева Е.В. Неразвивающаяся беременность: этиология, патогенез, клиника, диагностика // Акушерство и гинекология. – 2005. – № 2. – С. 3-7.
8. Пастман Н.М., Черных Е.Р., Хонина Н.А. и др. Иммунный статус женщин группы высокого риска по преждевременному прерыванию беременности. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2010. – Т. 9, № 4. – С. 28-32.
9. Подколзова Н.М., Скворцова М.Ю., Мельникова Н.И., Острейков И.Ф. Внутриутробная инфекция: современное состояние проблемы // Акушерство и гинекология. — 2009. — № 3. – С. 27-32.
10. Радзинский В.Е., Майскова И.Ю., Димитрова В.И. Комплексный подход к лечению неразвивающейся беременности в ранние сроки // Гинекология: журнал для практических врачей. – 2008. – № 1. – С. 6.
11. Савичева А.М., Шипицына Е.В. Перинатальные инфекции: проблемы  и пути их решения // Акушерство и гинекология. -2009. — № 3. – С.33-38.
12. Чистякова Г.Н., Газиева И.А., Ремизова И.И. и др. Оценка цитокинового профиля при физиологической и патологически протекающей беременности // Цитокины и воспаление. – 2007. – Т. 6,  №1. – С. 3-8.
13. Avgil M., Diav-Citrin O., Shechtman S., Arnon .J, et al. Epstein-Barr virus infection in pregnancy-a prospective controlled study // Reprod Toxicol. – 2008. — Vol. 25, № 4. – P. 468 — 471.
14. Dangel V., Bader U., Enders G. Improvement of cytomegalovirus avidity testing by adjusting the concentration of CMV-specific IgG in test samples // J Clin Virol. — 2006. — № 3. – Р. 303-309.
15. Eskild A, Bruu AL, Stray-Pedersen B, Jenum P. Epstein-Barr virus infection during pregnancy and the risk of adverse pregnancy outcome. // B.J.O.G. – 2005. — Vol. 112, № 12. – P. 1620-1624.
16. Kimberlin David W. Herpess Simplex Virus Infections of Newborn /  David W. Kimberlin // Curr. Probl. Pediatr Adolesc Health Care. – 2009. — № 39. — Р. 7-23.
17. Milewska — Bobula B. Congenital cytomegalovirus infection—clinical characteristics including prenatal diagnosis // Med Wieku Rozwoj. —  2003. — Jul-Sep. — Vol. 7(3 Suppl 1). — P.123-127.
18. Pistorius L.R., Smal J., de Haan T.R. et al. Disturbance of cerebral neuronal migration following congenital parvovirus B19 infection // Fetal. Diagn. Ther. – 2008. – Vol. 24, № 4. – P. 491 – 494.
19. Schleiss Mark R. Persistent and Recurring Viral Infections: The Human Herpesviruses // Curr probl Pediatr Adolesc Health Care. – 2009. — № 39. — Р. 7-23.
20. Sheiner E., Mazor-Drey E., Levy A. Asymptomatic bacteriuria during pregnancy // J. Matern. Fetal neonatal Med. – 2009. — № 5. – P. 423-427.