Тенденции развития и технологии современной лабораторной медицины

Транс­ля­ци­он­ная,пре­дик­тив­ная, 
пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ная и ла­бо­ра­тор­ная ме­ди­ци­на

Ла­бо­ра­тор­ная ме­ди­ци­на в на­сто­я­щее вре­мя ста­но­вит­ся са­мо­сто­я­тель­ной на­уч­но-прак­ти­чес­кой дис­цип­ли­ной и от­рас­лью ме­ди­цин­ских зна­ний, ос­но­во­по­ла­га­ю­щей от­но­си­тель­но всех ви­дов кли­ни­чес­кой де­ятель­нос­ти, с соб­ст­вен­ны­ми те­о­ри­ей, ме­то­да­ми и объ­ек­та­ми ана­ли­за, что свя­за­но с ре­зуль­та­та­ми мно­го­лет­них ме­ди­цин­ских ис­сле­до­ва­ний и ин­тег­ра­ци­ей с фун­да­мен­таль­ны­ми на­ука­ми: фи­зи­кой, хи­ми­ей, био­ло­ги­ей, ге­не­ти­кой и др. Ла­бо­ра­тор­ная ме­ди­ци­на – меж­дис­цип­ли­нар­ная на­ука, объ­е­ди­ня­ю­щая дос­ти­же­ния ме­ди­ци­ны и ес­тес­т­воз­на­ния и вы­яв­ля­ю­щая наи­бо­лее зна­чи­мые кли­ни­чес­кие мар­ке­ры на раз­лич­ных уров­нях ана­ли­за (клет­ки, ме­та­бо­ли­ты, бел­ки, ге­не­ти­чес­кие по­ли­мор­физ­мы и др.) для опре­де­ле­ния их зна­че­ния в нор­ме, ха­рак­те­ра и при­чин из­ме­не­ний в па­то­ло­ги­чес­ких про­цес­сах с ис­поль­зо­ва­ни­ем био­ин­фор­ма­ти­ки, на­хож­де­ния на этой ос­но­ве ме­то­дов адек­ват­ной те­ра­пии.

В свя­зи воз­ник­но­ве­ни­ем в по­след­нее вре­мя транс­ля­ци­он­ной, пре­дик­тив­ной, пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ной и до­ка­за­тель­ной ме­ди­ци­ны по­яви­лась на­сто­я­тель­ная не­об­хо­ди­мость ана­ли­за тен­ден­ций раз­ви­тия, пер­с­пек­тив­ных на­прав­ле­ний, оцен­ки ро­ли и по­ло­же­ния со­вре­мен­ной ла­бо­ра­тор­ной ме­ди­ци­ны в об­щей сис­те­ме кли­ни­чес­ких дис­цип­лин, что об­ус­лов­ле­но тре­бо­ва­ни­я­ми, ко­то­рые вы­дви­га­ют­ся в свя­зи со стре­ми­тель­ным раз­ви­ти­ем и внед­ре­ни­ем дос­ти­же­ний на­уки и но­вых тех­но­ло­гий. Для пра­виль­но­го по­ни­ма­ния на­прав­ле­ния и стра­те­гии раз­ви­тия, не­об­хо­ди­мо уточ­не­ние опре­де­ле­ний и за­дач, воз­ни­ка­ю­щих в по­след­ний пе­ри­од, но­вых на­прав­ле­ний со­вре­мен­ной ме­ди­ци­ны, бо­лее глу­бо­кий ана­лиз ха­рак­те­ра меж­дис­цип­ли­нар­ных от­но­ше­ний.

Транс­ля­ци­он­ную ме­ди­ци­ну мож­но рас­смат­ри­вать как про­цесс, пред­у­смат­ри­ва­ю­щий пе­ре­нос от­кры­тий, сде­лан­ных в ре­зуль­та­те фун­да­мен­таль­ных ис­сле­до­ва­ний в био­ме­ди­ци­не, в ме­ди­цин­скую прак­ти­ку с це­лью улуч­ше­ния ди­аг­нос­ти­ки и ле­че­ния. По мне­нию экс­пер­тов Евро­со­ю­за 2008 г., транс­ля­ци­он­ной ме­ди­ци­не бу­дет при­над­ле­жать ве­ду­щая роль в раз­ви­тии био­ме­ди­ци­ны на про­тя­же­нии бли­жай­ших де­ся­ти­ле­тий. За­да­чи транс­ля­ци­он­ной ме­ди­ци­ны в ди­аг­нос­ти­ке пред­у­смат­ри­ва­ют рас­поз­на­ва­ние всех пер­вич­ных и вто­рич­ных ме­ди­а­то­ров за­бо­ле­ва­ния, раз­ви­тие тех­но­ло­ги­чес­кой и ин­стру­мен­таль­ной ба­зы, соз­да­ние ди­аг­нос­ти­чес­ких про­то­ко­лов и эф­фек­тив­ной, эко­но­мич­ной ди­аг­нос­ти­ки. Пер­вый ин­сти­тут транс­ля­ци­он­ной ме­ди­ци­ны и те­ра­пии (ITMAT) соз­дан в на­ча­ле 2005 го­да в США, а в 2010 го­ду в Ка­ли­фор­нии (Сан-Фран­цис­ко) на ис­сле­до­ва­ния в ука­зан­ной об­лас­ти вы­де­ле­но 1,5 млрд. дол­ла­ров. Во Фран­ции ре­а­ли­зу­ет­ся про­грам­ма SESAM по оцен­ке до­кли­ни­чес­ких при­зна­ков па­то­ло­гии и опре­де­ле­ние склон­нос­ти че­ло­ве­ка к раз­лич­ным за­бо­ле­ва­ни­ям, а в Ве­ли­ко­бри­та­нии «Био­банк» по ге­не­ти­чес­кой ин­фор­ма­ции о бри­тан­цах раз­лич­ных эт­ни­чес­ких групп. При­ори­тет­ной за­да­чей транс­ля­ци­он­ной ме­ди­ци­ны яв­ля­ет­ся раз­ра­бот­ка ин­но­ва­ци­он­ных ме­то­дов мо­ле­ку­ляр­ной ди­аг­нос­ти­ки. Одним из эта­пов при­ме­не­ния транс­ля­ци­он­ных ме­ди­цин­ских под­хо­дов яв­ля­ет­ся оцен­ка кли­ни­чес­кой по­лез­нос­ти ис­поль­зо­ва­ния от­кры­тия, ор­га­ни­за­ция со­от­вет­ст­ву­ю­щих ис­сле­до­ва­ний, со­вер­шен­ст­во­ва­ние до­ка­за­тель­ных ре­ко­мен­да­ций, ор­га­ни­за­ция рас­прос­т­ра­не­ния ди­аг­нос­ти­чес­ких и ле­чеб­ных ме­то­дик и внед­ре­ние их в прак­ти­ку здра­во­ох­ра­не­ния.

Пре­дик­тив­ная, пре­вен­тив­ная (пред­у­пре­ди­тель­ная) ме­ди­ци­на (ме­ди­ци­на прог­но­за и ди­аг­нос­ти­ки) – од­но из наи­бо­лее пер­с­пек­тив­ных на­прав­ле­ний и дос­ти­же­ний со­вре­мен­ной мо­ле­ку­ляр­ной ме­ди­ци­ны, ко­то­рая из­уча­ет воз­мож­ность прог­но­зи­ро­ва­ния (пред­ви­де­ния) за­бо­ле­ва­ния у че­ло­ве­ка на ос­но­ве ис­сле­до­ва­ния ин­ди­ви­ду­аль­ных осо­бен­нос­тей его ге­но­ма, про­те­о­ма, мик­ро­би­о­ма и осо­бен­нос­тей ме­та­бо­лиз­ма. Ука­зан­ный тер­мин пред­ло­жил в 1977 го­ду, за­дол­го до ре­а­ли­за­ции про­ек­та «Ге­ном че­ло­ве­ка» фран­цуз­ский уче­ный, ла­у­ре­ат Но­бе­лев­ской пре­мии Дж. Дос­сэ, ко­то­рый об­на­ру­жил ас­со­ци­а­ции опре­де­лен­ных ва­ри­ан­тов (ал­ле­лей) ге­не­ти­чес­ко­го ло­ку­са HLA с не­ко­то­ры­ми муль­ти­фак­тор­ны­ми за­бо­ле­ва­ни­я­ми (са­хар­ным ди­а­бе­том, брон­хи­аль­ной ас­т­мой и др.).

Ме­то­ди­чес­кую ос­но­ву пре­ди­к­тив­ной ме­ди­ци­ны со­став­ля­ет вы­яв­ле­ние ге­нов, опре­де­лен­ные ал­ле­ли ко­то­рых пред­рас­по­ла­га­ют или на­обо­рот пре­пят­ст­ву­ют раз­ви­тию раз­лич­ных за­бо­ле­ва­ний, состав­ле­ние ген­ной се­ти для каж­до­го муль­ти­фак­тор­но­го за­бо­ле­ва­ния, иден­ти­фи­ка­ция в ней цен­т­раль­ных ге­нов и ге­нов мо­ди­фи­ка­то­ров. Ге­не­ти­чес­кие по­ли­мор­физ­мы, в от­ли­чие от му­та­ций, ко­то­рые мо­гут при­во­дить к па­то­ло­ги­чес­ким из­ме­не­ни­ям и сни­жа­ют жиз­нес­по­соб­ность, про­яв­ля­ют­ся в фе­но­ти­пе ме­нее од­но­знач­но и от­чет­ли­во. Сте­пень учас­тияраз­ных ге­нов в раз­ви­тии па­то­ло­ги­чес­ких про­цес­сов да­ле­ко не оди­на­ко­ва: прак­ти­чес­ки для каж­дой бо­лез­ни мож­но вы­де­лить глав­ные ге­ны, про­дук­ты ко­то­рых иг­ра­ют клю­че­вую роль в ини­ци­а­ции па­то­ло­гии и вто­ро­сте­пен­ные, чьи про­дук­ты иг­ра­ют до­пол­ни­тель­ную роль.Та­ким об­ра­зом, тес­ти­руя по­ли­мор­физ­мы ге­нов мож­но пред­ска­зать, ка­кая па­то­ло­гия и с ка­кой ве­ро­ят­нос­тью ожи­да­ет дан­но­го ин­ди­ви­ду­у­ма в бу­ду­щем, вы­яв­ле­нию ран­них, сред­них и поз­д­них ге­не­ти­чес­кие бо­лез­ней.

Пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ная ме­ди­ци­на пред­став­ля­ет со­бой ин­тег­раль­ную ме­ди­ци­ну, ко­то­рая вклю­ча­ет в се­бя раз­ра­бот­ку пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ных средств ле­че­ния, тес­ти­ро­ва­ния на пред­рас­по­ло­жен­ность к бо­лез­ням, про­фи­лак­ти­ку, объ­е­ди­не­ние ди­аг­нос­ти­ки с ле­че­ни­ем и мо­ни­то­рин­гом ле­че­ния. Впер­вые тер­мин «personalized medicine» по­явил­ся в мо­но­гра­фии Jain R.R. в 1998 го­ду.

Це­лью внед­ре­ния ос­нов­ных под­хо­дов и прин­ци­пов до­ка­за­тель­ной ла­бо­ра­тор­ной ме­ди­ци­ны яв­ля­ет­ся ис­поль­зо­ва­ние в кли­ни­чес­кой прак­ти­ке объ­ек­тив­ных, на­уч­но об­ос­но­ван­ных кри­те­ри­ев по всем ас­пек­там де­ятель­нос­ти: на пре­ана­ли­ти­чес­ком, ана­ли­ти­чес­ком и по­ста­на­ли­ти­чес­ком эта­пах. При этом не­об­хо­дим вы­бор наи­бо­лее эф­фек­тив­ных стра­те­ги­чес­ких ре­ше­ний и оп­ти­маль­ных, без­опас­ных и эко­но­ми­чес­ки об­ос­но­ван­ных ва­ри­ан­тов со­вре­мен­ных ди­аг­нос­ти­чес­ких под­хо­дов в каж­дом кон­к­рет­ном слу­чае.

Ла­бо­ра­тор­ная ме­ди­ци­на, как и ме­ди­ци­на в це­лом, до не­дав­не­го вре­ме­ни за­ни­ма­лась вы­яв­ле­ни­ем мар­ке­ров ди­аг­нос­ти­ки раз­лич­ных за­бо­ле­ва­ний, на­чи­ная с ран­них ста­дий. Меж­ду тем, чем рань­ше ве­ро­ят­ность воз­ник­но­ве­ния за­бо­ле­ва­ний бу­дет об­на­ру­же­на, тем эф­фек­тив­нее мо­жет быть про­фи­лак­ти­ка и ле­че­ние. До­кли­ни­чес­кая ста­дия за­бо­ле­ва­ний, по­иск со­от­вет­ст­ву­ю­щих би­о­мар­ке­ров и опре­де­ле­ние их ре­фе­рен­т­ных зна­че­ний, до не­дав­не­го вре­ме­ни не яв­ля­лась ос­нов­ным объ­ек­том ана­ли­за. Ис­то­ри­чес­ки ме­ди­ци­на на про­тя­же­нии сво­е­го раз­ви­тия уде­ля­ла вни­ма­ние за­бо­лев­ше­му па­ци­ен­ту, при этом ни­ка­ко­го вни­ма­ния не уде­ля­лось до­но­зо­о­ло­ги­чес­ким со­сто­я­ни­ям. Вмес­те с тем вы­яв­ле­ние до­кли­ни­чес­ких про­яв­ле­ния за­бо­ле­ва­ний на ос­но­ве ана­ли­за би­о­мар­ке­ров, пре­вен­тив­но-про­фи­лак­ти­чес­ких под­хо­дов яв­ля­ет­ся пер­с­пек­тив­ным на­прав­ле­ни­ям раз­ви­тия со­вре­мен­ной ме­ди­ци­ны.

В за­ви­си­мос­ти от по­став­лен­ных за­дач, био­ло­ги­чес­кой слож­нос­ти объ­ек­тов ис­сле­до­ва­ния, при­ме­ня­е­мых био­тех­но­ло­гий, ла­бо­ра­тор­ная ме­ди­ци­на мо­жет фун­к­ци­о­ни­ро­вать на раз­лич­ных уров­нях.

Ме­та­бо­ло­ми­ка от­ра­жа­ет фун­к­ци­о­наль­ное со­сто­я­ние и про­цес­сы про­ис­хо­дя­щие в опре­де­лен­но­го ти­па клет­ках и их из­ме­не­ния во вре­ме­ни, в том чис­ле свя­зан­ные с пе­ре­да­чей сиг­на­лов от по­вер­х­нос­ти кле­ток к фак­то­рам транс­крип­ции в яд­ре.

Ге­ном и ге­не­ти­чес­кие по­ли­мор­физ­мы: раз­ли­ча­ют ка­чес­т­вен­ный ге­не­ти­чес­кий по­ли­мор­физм ко­то­рый пред­став­лен пре­иму­щес­т­вен­но од­но­нук­ле­о­тид­ны­ми за­ме­на­ми (ОНП, SNP) и ко­ли­чес­т­вен­ный, пред­став­лен­ный в час­т­нос­ти ва­ри­а­ци­ями чис­ла тан­дем­ных по­вто­ров (STR – Short Tandem, 1–2 ли­бо 3–4 нук­ле­о­ти­дов на по­вто­ря­ю­щу­юся еди­ни­цу). Пер­вые кар­ты ОНП бы­ли со­став­ле­ны при ак­тив­ном учас­тии ка­ли­фор­ний­ской фир­мы «Пер­ли­ген» (PERLEGEN), опуб­ли­ко­вав­шей ре­зуль­та­ты сво­их ис­сле­до­ва­ний SNP в ге­но­ме че­ло­ве­ка. В но­яб­ре 2001 г. уче­ные ком­па­нии сек­ве­ни­ро­ва­ли 50 пол­ных гап­ло­ид­ных ге­но­мов, об­на­ру­жив 1,7 млн. SNP. В на­сто­я­щее вре­мя по­сле ре­а­ли­за­ции про­ек­та НарМар в ба­зах дан­ных хра­нит­ся ин­фор­ма­ция о бо­лее чем 10 млн. SNP.

По­вто­ры ДНК мо­гут иметь и боль­шую про­тя­жен­ность и ва­ри­а­бель­ную по нук­ле­о­тид­но­му со­ста­ву внут­рен­нюю струк­ту­ру (VNTR – Variable Number Tandem Repeats). В 2006 г. в жур­на­ле Nature бы­ли опуб­ли­ко­ва­ны ре­зуль­та­ты ра­бо­ты R. Redon и со­ав­то­ра­ми, ко­то­рые об­на­ру­жи­ли но­вый тип ва­ри­а­ций в ге­но­ме че­ло­ве­ка – CNVs (copy number variations). Бы­ло об­на­ру­же­но око­ло 150 учас­т­ков, в ко­то­рых при­сут­ст­во­ва­ли зна­чи­тель­ные по дли­не (от не­сколь­ких ты­сяч до не­сколь­ких мил­ли­онов пар нук­ле­о­ти­дов) дуп­ли­ка­ции (удво­е­ние) и де­ле­ции фраг­мен­тов ДНК. Про­тя­жен­ность этих учас­т­ков до­воль­но ве­ли­ка – в це­лом, по оцен­ке ав­то­ров ра­бо­ты, она со­став­ля­ет до 12% все­го ге­но­ма, т.е. вклад CNVs в ва­ри­а­тив­ность ге­но­ма со­пос­та­вим с вкла­дом SNP или да­же пре­вы­ша­ет его. К на­сто­я­ще­му вре­ме­ни об­на­ру­жен­ные CNVs мо­гут быть при­чи­ной не­сколь­ких де­сят­ков спа­ра­ди­чес­ких за­бо­ле­ва­ний, вы­зван­ных ге­ном­ны­ми пе­ре­строй­ка­ми: по­яви­лись со­об­ще­ния об их свя­зи с 17 бо­лез­ня­ми че­ло­ве­ка, в том чис­ле сис­тем­ны­ми ауто­им­мун­ны­ми и пси­хи­чес­ки­ми. В на­сто­я­щее вре­мя про­ве­де­ны по­ли­ге­ном­ные ис­сле­до­ва­ния CNVs и ве­дет­ся соз­да­ние ба­зы дан­ных, как бы­ло ра­нее сде­ла­но для по­ли­мор­физ­мов в «НарМар».

Ис­сле­до­ва­ние транс­крип­том­но­го про­фи­ля в раз­лич­ных ти­пах кле­ток и их из­ме­не­ния у дан­но­го па­ци­ен­та со вре­ме­нем пред­став­ля­ет ак­ту­аль­ную за­да­чу. В кли­ни­чес­ких ис­пы­та­ни­ях до­ка­за­но, что фак­то­ры, ме­ня­ю­щие экс­прес­сию ге­нов, де­лят­ся на че­ты­ре груп­пы: спо­соб и тип пи­та­ния; фак­то­ры окру­жа­ю­щей сре­ды, кли­ма­та, уров­ня ра­ди­а­ции, воз­дей­ст­вия ксе­но­би­о­ти­ков, об­ра­за; фи­зи­чес­кие на­груз­ки, их тип и ре­гу­ляр­ность; эмо­ци­о­наль­но-пси­хо­ло­ги­чес­кий ста­тус, уро­вень стрес­са.

По срав­не­нию с ис­сле­до­ва­ни­ем ге­но­ма, ана­лиз про­те­о­ма пред­став­ля­ет со­бой су­щес­т­вен­но бо­лее слож­ную за­да­чу. Про­те­о­ми­ка ес­тес­т­вен­ным об­ра­зом яв­ля­ет­ся про­дол­же­ни­ем фун­к­ци­о­наль­ной ге­но­ми­ки и транс­крип­то­ми­ки, так как по­зво­ля­ет сле­дить за бел­ко­вы­ми вза­и­мо­дей­ст­ви­я­ми. Ме­то­да­ми ла­бо­ра­тор­ной ме­ди­ци­ны (элек­т­ро­фо­рез, масс-спек­т­ро­мет­рия, им­му­но­хи­ми­чес­кий ана­лиз) воз­мож­но про­во­дить пол­ный ана­лиз про­те­о­ма: всех бел­ков, ко­то­рые со­дер­жать­ся в кли­ни­чес­ком ма­те­ри­а­ле. Чрез­вы­чай­но важ­но при этом опре­де­ле­ние ка­чес­т­вен­но­го и ко­ли­чес­т­вен­но­го со­ста­ва всех бел­ков, а так­же про­ве­де­ние мо­ни­то­рин­га за ди­на­ми­кой из­ме­не­ний при воз­ник­но­ве­нии па­то­ло­гии и при­ме­не­нии те­ра­пии.

По­сле фор­ми­ро­ва­ния кон­цеп­ций «ге­но­ма» и «про­те­о­ма» воз­ник­ла проб­ле­ма «гли­ко­ма» – со­во­куп­ность кле­точ­ных оли­го­са­ха­ри­дов, ко­то­рые зна­чи­тель­но мно­го­об­раз­нее и слож­нее нук­ле­и­но­вых кис­лот и бел­ков, а пред­став­ле­ние об их био­ло­ги­чес­кой ро­ли бо­лее фраг­мен­тар­ны. Им­мо­би­ли­за­ция оли­го­са­ха­ри­дов на мик­ро­чи­пы – не­об­хо­ди­мый этап в из­уче­нии их вза­и­мо­дей­ст­вия с бел­ка­ми.

Мо­ле­ку­ляр­но-био­ло­ги­чес­кие тех­но­ло­гии 
пер­со­на­ли­зи­ро­ван­нной ме­ди­ци­ны

Три важ­ней­ших тех­но­ло­гии, име­ют от­но­ше­ние к пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ной ме­ди­ци­не: ге­но­ти­пи­ро­ва­ние SNP, мик­ро­чи­пы/би­о­чи­пы и сек­ве­ни­ро­ва­ние Для по­ис­ка и иден­ти­фи­ка­ции SNP раз­ра­бо­та­ны и при­ме­ня­ют­ся око­ло сот­ни раз­лич­ных ме­то­дов, ос­но­вой боль­шо­го ко­ли­чес­т­ва ко­то­рых со­став­ля­ют раз­но­вид­нос­ти по­ли­ме­раз­ной цеп­ной ре­ак­ции (ПЦР).

Основ­ные ме­то­ды ла­бо­ра­тор­ной ме­ди­ци­ны, ко­то­рые при­ме­ня­ют­ся в пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ной и пре­дик­тив­ной ме­ди­ци­не:

• Ме­то­ды, ос­но­ван­ные на по­ли­ме­раз­ной цеп­ной ре­ак­ции (ПЦР):

• ПЦР в ре­жи­ме ре­аль­но­го вре­ме­ни (ПЦР РВ)

• ПЦР с ис­поль­зо­ва­ни­ем об­рат­ной транс­крип­та­зы 
(ОТ ПЦР)

• По­ли­мор­физм дли­ны рес­т­рик­ци­он­ных фраг­мен­тов (RFLP)

• Кон­фор­ма­ци­он­ный по­ли­мор­физм од­но­ни­те­вых фраг­мен­тов (SSCP)

• Ме­то­ды, не ос­но­ван­ные на ПЦР

• Ана­ли­зы на ос­но­ве ре­зо­нан­с­но­го пе­ре­но­са энер­гии флу­о­рес­цен­ции (FRET)

• Транс­крип­ци­он­но-опос­ре­до­ван­ная ам­п­ли­фи­ка­ция (TAS)

• Ци­то­ге­не­ти­ка

• Срав­ни­тель­ная ге­ном­ная гиб­ри­ди­за­ция (CGH) 
Флу­о­рес­цен­т­ная гиб­ри­ди­за­ция in situ (FISH)

• Суп­рес­си­он­ная вы­чи­та­ю­щая гиб­ри­ди­за­ция (SSH)

• На­но­ди­аг­нос­ти­ка

• Ин­тег­ра­ция ди­аг­нос­ти­ки с те­ра­пи­ей на ос­но­ве на­но­час­тиц

• Уточ­не­ния ди­аг­нос­ти­ки для це­лей фар­ма­ко­ге­не­ти­ки

• Ме­то­ды про­те­о­ми­ки

• Флу­о­рес­цен­т­ная де­тек­ция бел­ка in situ

• Про­те­ин/пеп­тид­ные чи­пы

• Тех­но­ло­гии про­те­и­но­вых би­о­чи­пов

• Ге­не­ти­чес­кие и мик­роф­лю­ид­ные мик­ро­чи­пы

• Тес­ты, ос­но­ван­ные на экс­прес­сии ге­нов

• ДНК сек­ве­ни­ро­ва­ние

• Мно­жес­т­вен­ное ДНК сек­ве­ни­ро­ва­ние

• Сек­ве­ни­ро­ва­ние в ре­ак­то­рах в пи­ко­лит­ро­вых мик­ро­объ­е­мах

• Сек­ве­ни­ро­ва­ние все­го ге­но­ма

• Ток­си­ко­ге­но­ми­ка

• Ге­но­ти­пи­ро­ва­ние оди­ноч­но­го нук­ле­о­тид­но­го по­ли­мор­физ­ма (SNP)

• Ис­сле­до­ва­ния ме­ти­ли­ро­ва­ния ДНК

• Мик­роРНК ди­аг­нос­ти­ка

Муль­ти­па­ра­мет­ри­чес­кие ис­сле­до­ва­ния

Ди­аг­нос­ти­чес­кая цен­ность мар­ке­ров обыч­но за­ви­сит от трех по­ка­за­те­лей: чув­ст­ви­тель­нос­ти, спе­ци­фич­нос­ти и пред­ска­за­тель­ной спо­соб­нос­ти (си­лы). Мар­ке­ры с иде­аль­ной спе­ци­фич­нос­тью и чув­ст­ви­тель­нос­тью ред­ки, од­на­ко при­чи­на поч­ти всех па­то­ло­гий ни­ког­да не бы­ва­ет един­ст­вен­ной, а об­ус­лов­ле­на ря­дом не­бла­го­при­ят­ных фак­то­ров. Воз­ник­ла острая не­об­хо­ди­мость в раз­ра­бот­ке стан­дар­т­ных ком­п­лек­сов мар­ке­ров, ко­то­рые бу­дут да­вать дос­то­вер­ную ди­аг­нос­ти­чес­кую ин­фор­ма­цию. По­сколь­ку вы­со­ко­тех­но­ло­гич­ные ме­то­ды по­зво­ля­ют уста­но­вить при­чин­но-след­ст­вен­ные в це­пи: ген-РНК-бе­лок-ме­та­бо­лит, та­кие ком­п­лек­сы мар­ке­ров мо­гут со­сто­ять из спе­ци­фи­чес­ких оли­го­нук­ле­о­ти­дов, бел­ков и ме­та­бо­ли­тов. Мно­жес­т­вен­ный ге­не­ти­чес­кий ана­лиз (би­о­чи­пы, муль­тип­рай­мер­ная ПЦР и др.), од­но­вре­мен­ный вы­со­ко­чув­ст­ви­тель­ный и вы­со­ко­спе­ци­фич­ный ана­лиз бел­ков, ме­та­бо­ли­тов, ви­ру­сов, мик­ро­ор­га­низ­мов позво­лит уско­рить и по­вы­сить эф­фек­тив­ность ме­то­дов моле­ку­ляр­ной ме­ди­ци­ны.

Су­щес­т­вен­ным пре­иму­щес­т­вом мо­ле­ку­ляр­но-ге­не­ти­чес­ких ди­аг­нос­ти­чес­ких ме­то­дов яв­ля­ет­ся воз­мож­ность од­но­вре­мен­ной и не­за­ви­си­мой де­тек­ции не­сколь­ких раз­лич­ных не­ра­ди­ои­зо­топ­ных гиб­ри­ди­за­ци­он­ных ме­ток, про­ве­де­ние муль­тип­рай­мер­ной ПЦР или ПЦР в ре­аль­ном вре­ме­ни с не­сколь­ки­ми па­ра­ми оли­го­нук­ле­о­тид­ных прай­ме­ров, что по­зво­ля­ет об­на­ру­жи­вать в од­ном об­раз­це раз­лич­ные воз­бу­ди­те­ли ин­фек­ци­он­ных за­бо­ле­ва­ний: ви­ру­сы, ми­ко­ор­га­низ­мы, гри­бы. Раз­ра­бот­кой и про­из­вод­ст­вом надеж­ных и эко­но­мич­ных оте­чес­т­вен­ных муль­тип­рай­мер­ных на­бо­ров за­ни­ма­ет­ся на­уч­но-про­из­вод­ст­вен­ная фир­ма «ГЕНТЕХ» (Мос­к­ва) (до пя­ти воз­бу­ди­те­лей в од­ной ре­ак­ции: хла­ми­дия тра­хо­ма­тис, ми­коп­лаз­ма ге­ни­та­ли­ум, ми­коп­лаз­ма го­ми­нис, уре­ап­лаз­ма уре­а­ли­ти­кум, уре­ап­лаз­ма Т 960), гер­пес­ви­ру­сов (ВПГ, ЦМВ, ЭБВ), па­пил­ло­ма­ви­ру­сов (ВПЧ 16, 18), пер­вый за­ре­гис­т­ри­ро­ван­ный МЗ РФ муль­тип­рай­мер­ный на­бор ре­а­ген­тов для од­но­вре­мен­но­го опре­де­ле­ния ДНК лак­то­ба­цилл (Lactobacillus spp.) и гар­д­не­рел­лы (Gardnerella vaginalis) ме­то­дом ПЦР (ЛактАм), а так­же на­бор «ТрифАм» для об­на­ру­же­ния гри­бов T. rubrum и T. interdigitale (ТрифАм), что важ­но в ди­аг­нос­ти­ке они­хо­ми­ко­зов.

Пер­с­пек­тив­ным на­прав­ле­ни­ем в муль­ти­па­ра­мет­ри­чес­ких ис­сле­до­ва­ни­ях яв­ля­ет­ся при­ме­не­ние мик­роф­лю­и­до­иных тех­но­ло­гий. Фир­мой Fluidigm раз­ра­бо­та­на тех­но­ло­гия Fluidic Circuit Technology (IFC) на ба­зе ко­то­рой соз­да­на плат­фор­ма для би­о­чи­па (Dynamic Array IFCs). Би­о­чип су­щес­т­ву­ет в двух фор­ма­тах 96.96 и со­дер­жит 9216 яче­ек и 48.48 и 2304 яче­ек со­от­вет­ст­вен­но, в каж­дой из ко­то­рых про­те­ка­ет ПЦР в ре­жи­ме ре­аль­но­го вре­ме­ни. Ис­поль­зу­е­мые мик­ро­объ­е­мы ре­ак­ти­вов по­зво­ля­ют зна­чи­тель­но эко­но­мить ре­а­ген­ты (6 мкл на об­ра­зец) и вре­мя, учи­ты­вая боль­шое ко­ли­чес­т­во од­но­вре­мен­но про­хо­дя­щих ре­ак­ций (10 мин. рас­ка­пы­ва­ние об­раз­цов, 45–90 мин. пе­ре­ме­ши­ва­ние в, 90 мин ПЦР и 5 мин счи­ты­ва­ние). Сис­те­ма яв­ля­ет­ся от­кры­той для при­ме­не­ния тех­но­ло­гий TaqMan, Roche UPL и ин­тер­ка­ли­ру­ю­щих кра­си­те­лей. С по­мо­щью би­о­чи­па ис­сле­ду­ют экс­прес­сию ге­нов, в том чис­ле в еди­нич­ных клет­ках, мик­ро РНК, ОНП – ти­пи­ро­ва­ние, CNV ва­ри­ан­ты. По­ка­за­ны воз­мож­нос­ти при­ме­не­ния би­о­чи­па в он­ко­ло­гии при вы­яв­ле­нии му­та­ции при ос­т­рой ми­е­ло­ид­ной лей­ке­мии, при­чем чув­ст­ви­тель­ность уда­лось уве­ли­чить в 50–100 раз.

Би­о­чи­пы

Ши­ро­кое внед­ре­ние мо­ле­ку­ляр­но-ге­не­ти­чес­ких ме­то­дов и из­об­ре­те­ние ме­ди­цин­ских би­о­чи­пов, в час­т­нос­ти для из­уче­ния по­ли­мор­физ­мов ге­нов сис­те­мы де­ток­си­ка­ции, от­кры­ло воз­мож­ность про­ве­де­ния муль­ти­па­ра­мет­ри­чес­ких ис­сле­до­ва­ний. Сло­жи­лась но­вая си­ту­а­ция в мо­ле­ку­ляр­ной ме­ди­ци­не, ког­да не экс­пе­ри­мен­ты под­твер­ж­да­ют но­вые ги­по­те­зы, а но­вые ди­аг­нос­ти­чес­кие под­хо­ды и на­бо­ры зна­чи­мых би­о­мар­ке­ров рож­да­ют­ся на ос­но­ве со­бран­ных мас­си­вов дан­ных. Би­о­чи­пы пред­став­ля­ют со­бой ми­ни­атюр­ные устрой­ства (при­спо­соб­ле­ния) для ана­ли­за спе­ци­фи­чес­ких вза­и­мо­дей­ст­вий био­ло­ги­чес­ких мак­ро­мо­ле­кул (оли­го­нук­ле­о­ти­ды, фраг­мен­ты ге­ном­ной ДНК, РНК, бел­ки, ре­цеп­то­ры, ли­ган­ды и дру­гие). Су­щес­т­ву­ет че­ты­ре ос­нов­ных ви­да би­о­чи­пов: ДНК, РНК, бел­ко­вые и кле­точ­ные.

Тех­но­ло­гии, ис­поль­зу­е­мые в био­ло­ги­чес­ких мик­ро­чи­пах – муль­ти­па­ра­мет­ри­чес­кие и кро­ме мат­рич­ной ар­хи­тек­ту­ры ре­а­ли­зу­ют­ся мик­роф­лю­ид­ные (или ка­пил­ляр­ные) под­хо­ды и мик­рос­фе­ры с цве­то­вой ко­ди­ров­кой. Прин­цип ми­ни­атю­ри­за­ции, ре­а­ли­зо­ван­ный в би­о­чи­пах, при­во­дит к сни­же­нию се­бе­сто­и­мос­ти и по­вы­ше­нию про­из­во­ди­тель­нос­ти вы­пол­не­ния ана­ли­за (не­сколь­ко де­сят­ков и со­тен па­ра­мет­ров од­но­вре­мен­но) и очень вы­со­кой ав­то­ма­ти­за­ции ис­сле­до­ва­ний. По­лу­чен­ные с по­мо­щью би­о­чи­пов дан­ные по­зво­ля­ют прог­но­зи­ро­вать и от­сле­жи­вать ди­на­ми­ку раз­ви­тия за­бо­ле­ва­ний, да­ют воз­мож­ность под­би­рать ин­ди­ви­ду­аль­но для каж­до­го че­ло­ве­ка наи­бо­лее эф­фек­тив­ные схе­мы ме­ди­ка­мен­тоз­но­го ле­че­ния ин­фек­ци­он­ных, он­ко­ло­ги­чес­ких, сер­деч­но-со­су­дис­тых и дру­гих за­бо­ле­ва­ний (прин­ци­пы пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ной ме­ди­ци­ны). Не­со­мнен­но, что в бли­жай­шее вре­мя мик­ро­би­о­чи­пы бу­дут су­щес­т­вен­но усо­вер­шен­ст­во­ва­ны (в том чис­ле с ис­поль­зо­ва­ни­ем тех­но­ло­гии ро­бо­тов), что сде­ла­ет про­це­ду­ру скри­нин­га муль­ти­фак­тор­ных. на­след­ст­вен­ных и ин­фек­ци­он­ных за­бо­ле­ва­ний ру­тин­ной, эко­но­мич­ной по за­тра­там тру­да и вре­ме­ни опе­ра­ци­ей.

Аме­ри­кан­ские уче­ные из ком­па­нии «Celera Diagnostics» и дру­гих на­уч­ных цен­т­ров про­ве­ли три не­за­ви­си­мых ис­сле­до­ва­ния по об­на­ру­же­нию ге­не­ти­чес­ких мар­ке­ров, ас­со­ци­и­ру­ющих­ся с ран­ним раз­ви­ти­ем ин­фар­к­та ми­о­кар­да. В ка­чес­т­ве мар­ке­ров-кан­ди­да­тов уче­ны­ми для ис­сле­до­ва­ний бы­ло ото­бра­но 11647 по­ли­мор­физ­мов 7136 ге­нов. В по­след­нем ис­сле­до­ва­нии при учас­тии 187 па­ци­ен­тов и 434 че­ло­век кон­т­роль­ной груп­пы из 8 по­ли­мор­физ­мов толь­ко 2 по­ка­за­ли дос­то­вер­ную ас­со­ци­а­цию с ин­фар­к­том ми­о­кар­да. Эти по­ли­мор­физ­мы пред­став­ле­ны в ге­нах VAMP8 (ре­гу­ли­ру­ет де­гра­ну­ля­цию тром­бо­ци­тов) и HNRPUL1 (ко­ди­ру­ет ри­бо­нук­ле­ар­ный бе­лок). Ра­нее эти­ми же уче­ны­ми бы­ла по­ка­за­на связь по­ли­мор­физ­мов ге­нов пал­ла­ди­на, ти­ро­зин­ки­на­зы и двух ре­цеп­то­ров, со­пря­жен­ных с G-бел­ка­ми (TAS2R50 и OR13G1) с бо­лее поз­д­ним раз­ви­ти­ем ин­фар­к­та ми­о­кар­да.

Су­щес­т­ву­ет два ос­нов­ных ти­па би­о­чи­пов, во-пер­вых, то­чеч­ный би­о­чип, по­лу­ча­е­мый на­не­се­ни­ем фраг­мен­тов ДНК на плат­фор­му и, во-вто­рых, оли­го­нук­ле­о­тид­ный би­о­чип вы­со­кой плот­нос­ти, ко­то­рый про­из­во­дят пу­тем пря­мо­го син­те­за оли­го­нук­ле­о­ти­дов на под­лож­ке. Пер­вые ДНК-чи­пы бы­ли по­лу­че­ны пу­тем пе­ре­но­са вруч­ную кло­ни­ро­ван­ных фраг­мен­тов ДНК на ней­ло­но­вые филь­т­ры и ис­поль­зо­ва­лись с ра­дио­изо­топ­но­ме­чен­ны­ми зон­да­ми. За­тем в ка­чес­т­ве под­лож­ки ста­ли при­ме­нять стек­ло для раз­ме­ще­ния дос­та­точ­но­го ко­ли­чес­т­ва проб и флу­о­рес­цен­т­но-ме­чен­ные зон­ды, так как стек­ло об­ла­да­ет низ­кой аутоф­лу­о­рес­цен­ци­ей. Та­кой ди­зайн би­о­чи­па по­зво­ля­ет ис­поль­зо­вать раз­но­об­раз­ные флу­о­рес­цен­т­ные кра­си­те­ли, по­лу­чать бо­лее вы­со­кое раз­ре­ше­ние: ячей­ки с ДНК мо­гут рас­по­ла­гать­ся на рас­сто­я­нии 0,3–0,5 мм (с плот­нос­тью 5000 яче­ек на кв. см.) и име­ют ты­ся­чи то­чек со­дер­жа­щих 10–12 пкмоль спе­ци­фи­чес­кой ДНК-про­бы.

Го­раз­до бо­лее вы­со­кую плот­ность мож­но по­лу­чить путем син­те­за оли­го­нук­ле­о­ти­дов in situ с ис­поль­зо­ва­ни­ем ли­тог­ра­фи­чес­ко­го про­цес­са, ко­то­рый был раз­ра­бо­тан и при­ме­нен од­ной из круп­ней­ших фирм по про­из­вод­ст­ву би­о­чи­пов ком­па­ни­ей Affimetrix (США). Би­о­чи­пы про­из­во­дят­ся с 1993 го­да, на­ра­щи­ва­ют­ся пря­мо из стек­лян­ной плас­тин­ки ме­то­дом фо­то­ли­тог­ра­фии с ис­поль­зо­ва­ни­ем спе­ци­аль­ных мик­ро­ма­сок. Хо­тя экс­пе­ри­мен­таль­но дос­тиг­ну­тая плот­ность со­ста­ви­ла до мил­ли­она яче­ек на квад­рат­ный сан­ти­метр, ком­мер­чес­ки вы­пус­ка­е­мый GeneChip име­ет плот­ность 64000 яче­ек на квад­рат­ный сан­ти­метр. Сна­ча­ла на стек­лян­ную по­вер­х­ность на­но­сит­ся по­кры­тие, что­бы мо­ле­ку­лы ДНК мож­но бы­ло ко­ва­лен­т­но при­со­е­ди­нить к по­вер­х­нос­ти плат­фор­мы. Оли­го­нук­ле­о­ти­ды син­те­зи­ру­ют­ся в опре­де­лен­ных по­зи­ци­ях пу­тем по­сле­до­ва­тель­но­го до­бав­ле­ния опре­де­лен­ных де­зок­си­нук­ле­о­зид­т­ри­фос­фа­тов, каж­дый из ко­то­рых мо­ди­фи­ци­ро­ван и име­ет фо­то­ла­биль­ную за­щит­ную груп­пу. ДНК не мо­жет быть удли­не­на, ес­ли не ак­ти­ви­ро­ва­на све­том. Фо­то­ли­тог­ра­фи­чес­кие мас­ки ука­зы­ва­ют те рай­оны, где мо­ле­ку­ла ДНК дол­ж­на быть удли­не­на, а где оста­ет­ся инер­т­ной. В за­ра­нее опре­де­лен­ных мес­тах син­те­зи­ру­ют­ся спе­ци­фи­чес­кие по­сле­до­ва­тель­нос­ти. Же­ла­тель­но, что­бы ДНК-чи­пы об­ла­да­ли дву­мя про­ти­во­ре­чи­вы­ми свой­ст­ва­ми: с од­ной сто­ро­ны, ин­те­рес­но в од­ном ДНК-чи­пе иметь как мож­но боль­ше яче­ек, что­бы по­лу­чить боль­ше ин­фор­ма­ции об из­уча­е­мом об­раз­це. В то же вре­мя, ис­сле­до­ва­те­ли за­час­тую вы­нуж­де­ны ра­бо­тать с очень ма­лы­ми объ­е­ма­ми био­ло­ги­чес­ко­го ма­те­ри­а­ла, по­это­му, чем мень­ше раз­мер ДНК-чи­па, тем луч­ше.

В Ин­сти­ту­те мо­ле­ку­ляр­ной био­ло­гии РАН про­ве­де­на так­же раз­ра­бот­ка ди­аг­нос­ти­чес­ких оли­го­нук­ле­о­тид­ных мик­ро­чи­пов для ди­аг­нос­ти­ки М. tuberculesis (ре­гис­т­ра­ция МЗСР РФ 2006 г.) и устой­чи­вых к ан­ти­би­о­ти­кам ри­фам­пи­ци­ну и изо­ни­а­зи­ду форм па­то­ге­на. Дру­гим на­прав­ле­ни­ем в ис­поль­зо­ва­нии би­о­чи­пов яв­ля­ет­ся иден­ти­фи­ка­ция му­та­ций в ге­но­ме че­ло­ве­ка: иден­ти­фи­ка­ция на­след­ст­вен­ных му­та­ций, вы­зы­ва­ю­щих за­бо­ле­ва­ния преж­де все­го он­ко­ло­ги­чес­кие и иден­ти­фи­ка­ция му­та­ций в ге­нах, от­вет­ст­вен­ных за био­тран­с­фор­ма­цию ле­кар­ст­вен­ных средств, глав­ным об­ра­зом, при­ме­ня­е­мых в хи­мио­те­ра­пии опу­хо­лей. Мик­ро­чи­пы для иден­ти­фи­ка­ции хро­мо­сом­ных пе­ре­стро­ек, вы­зы­ва­ю­щих ос­т­рый лей­коз, а так­же мик­ро­чип для вы­яв­ле­ния пя­ти наи­бо­лее рас­прос­т­ра­нен­ных му­та­ций в ге­не BRCA1, уве­ли­чи­ва­ю­щих риск ра­ка мо­лоч­ной же­ле­зы и не­ко­то­рых дру­гих он­ко­ло­ги­чес­ких за­бо­ле­ва­ний. Кар­ди­о­чип спо­со­бен опре­де­лять од­но­вре­мен­но во­семь од­но­нук­ле­о­тид­ных по­ли­мор­физ­мов се­ми ге­нов (REN, AGT, AGTR1, AGTR2, BKR2, MTHFR, ADRB2), что зна­чи­тель­но со­кра­ща­ет вре­мя про­це­ду­ры и сни­жа­ет се­бе­сто­и­мость ана­ли­за для вы­яв­ле­ния сте­пе­ни рис­ка раз­ви­тия сер­деч­но-со­су­дис­тых па­то­ло­гий. В свою оче­редь с по­мо­щью фар­ма­ко­ге­не­ти­чес­ко­го би­о­чи­па, ана­ли­зи­ру­ю­ще­го 14 по­ли­мор­физ­мов из­вест­ных ге­нов де­ток­си­ка­ции, от­кры­ва­ет­ся воз­мож­ность под­бо­ра оп­ти­маль­ных лекар­ст­вен­ных пре­па­ра­тов и их доз для ле­че­ния ши­ро­ко­го кру­га боль­ных.

Оли­го­нук­ле­о­тид­ные экс­прес­си­он­ные мик­ро­чи­пы гиб­ри­ди­зу­ют­ся со сме­сью кон­т­роль­ной мРНК и из­уча­е­мой мРНК. В экс­прес­си­он­ных чи­пах с кДНК гиб­ри­ди­зу­ют­ся со сме­сью ДНК, по­лу­чен­ной в ре­зуль­та­те об­рат­ной транс­крип­ции кон­т­роль­ной мРНК и из­уча­е­мой мРНК (так на­зы­ва­е­мые ДНК-ко­пии). Каж­дая из ком­по­нент сме­си ме­тит­ся сво­ей флу­о­рес­цен­т­ной мет­кой (обыч­но ис­поль­зу­ет­ся па­ра Cy3/Cy5/). Нор­ми­ро­ван­ное от­но­ше­ние сиг­на­лов флу­о­рес­цен­ции да­ет ин­фор­ма­цию об уров­не экс­прес­сии, при со­от­но­ше­нии боль­ше еди­ни­цы и боль­ше по­ро­га ста­тис­ти­чес­кой зна­чи­мос­ти име­ет мес­то по­вы­ше­ние экс­прес­сии ге­на, в про­тив­ном слу­чае – по­ни­же­ние. В на­сто­я­щее вре­мя в экс­прес­си­он­ных мик­ро­чи­пах ис­поль­зу­ют им­мо­би­ли­зо­ван­ную ДНК двух ти­пов: во-пер­вых, от­но­си­тель­но ко­рот­кие ген-спе­ци­фич­ные фраг­мен­ты ДНК дли­ной 20–60 нук­ле­о­ти­дов (оли­го­нук­ле­о­тид­ные мик­ро­чи­пы фир­мы Affymetrix); во-вто­рых, круп­ные фраг­мен­ты кДНК дли­ной 100–600-нук­ле­о­ти­дов, по­лу­ча­е­мые в ре­зуль­та­те кло­ни­ро­ва­ния, ПЦР-ам­п­ли­фи­ка­ции и очис­т­ки (кДНК-мик­ро­чи­пы фир­мы Incyte).

Су­щес­т­ву­ет два ос­нов­ных ти­па бел­ко­вых мик­ро­чи­пов – ана­ли­ти­чес­кие или фун­к­ци­о­наль­ные чи­пы, в ко­то­рых са­ми ис­сле­ду­е­мые бел­ки им­мо­би­ли­зу­ют­ся на би­о­чи­пе и при­ме­ня­ют­ся для ис­сле­до­ва­ния био­хи­ми­чес­кой ак­тив­нос­ти и вза­и­мо­дей­ст­вия бел­ков. Би­о­чи­пы фир­мы Dr.Fooke пред­ноз­на­че­ны для од­но­вре­мен­но­го ко­ли­чес­т­вен­но­го опре­де­ле­ния шес­ти мар­ке­ров он­ко­ло­ги­чес­ких за­бо­ле­ва­ний: прос­тат-спе­ци­фи­чес­ко­го ан­ти­ге­на (об­щей и сво­бод­ной форм), аль­фа-фе­топ­ро­те­и­на, ра­ко­во­го эм­б­ри­о­наль­но­го ан­ти­ге­на, хро­ни­чес­ко­го го­на­дот­ро­пи­на и ней­рон-спе­ци­фи­чес­кой эно­ла­зы.

Ана­ли­ти­чес­кие чи­пы при­ме­ня­ют­ся для мо­ни­то­рин­га, а ис­сле­ду­е­мые бел­ки на­хо­дят­ся в об­раз­це, ко­то­рым об­ра­ба­ты­ва­ет­ся би­о­чип, на ко­то­ром им­мо­би­ли­зо­ва­ны улав­ли­ва­ю­щие аген­ты в ка­чес­т­ве ко­то­рых при­ме­ня­ют­ся бел­ки, ан­ти­те­ла, лек­ти­ны, оли­го­нук­ле­о­тид­ные ап­та­ме­ры или хи­ми­чес­кие ве­щес­т­ва, свя­зы­ва­ю­щие опре­де­лен­ные клас­сы бел­ков. По­сле­ду­ю­щий ана­лиз осу­щес­т­в­ля­ет­ся масс-спек­т­ро­мет­ри­чес­ким ана­ли­зом или де­тек­ци­ей с ис­поль­зо­ва­ни­ем ме­то­да спек­т­рос­ко­пии по­вер­х­нос­т­но­го плаз­мен­но­го ре­зо­нан­са. Cоз­дан­ный ком­па­ни­ей Vermillion Inc, ProteinChip иг­ра­ет в про­те­о­ми­ке та­кую же роль, как GeneChip в ге­не­ти­чес­ких ис­сле­до­ва­ни­ях и ос­но­ван та тех­но­ло­гии SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization). На та­кой чип мо­гут быть им­мо­би­ли­зо­ва­ны ан­ти­ге­ны, ан­ти­те­ла и фер­мен­ты. Основ­ные эта­пы ана­ли­за: об­ра­зец па­ци­ен­та на­но­сить­ся на чип, за­тем про­во­дить­ся уси­ле­ние со­от­но­ше­ния по­лез­ный сиг­нал-шум, с по­мо­щью тех­но­ло­гии SELDI по­лу­ча­ет­ся ин­фор­ма­ция о мо­ле­ку­ляр­ном ве­се ми­ше­ни и срав­не­ния с кон­т­роль­ны­ми об­раз­ца­ми.

По­лу­чен­ные про­те­и­но­вые про­фи­ли мо­гут при­ме­нять­ся для срав­не­ния нор­маль­ных, ран­них и ме­та­ста­зи­ру­ю­щих ра­ко­вых кле­ток.

В на­сто­я­щее вре­мя уже соз­да­ны об­раз­цы бел­ко­вых би­о­чи­пов для ана­ли­за про­фи­ля кро­вет­вор­ных фак­то­ров (ци­то­ки­нов) сы­во­рот­ки до­но­ров (Novagen, Biomax, Clontech), для ал­ле­ро­го­ди­аг­нос­ти­ки од­но­вре­мен­но не­сколь­ко де­сят­ков при­род­ных ал­лер­ге­нов, гор­мо­нов, мар­ке­ров сер­деч­но-со­су­дис­тых за­бо­ле­ва­ний (VBC-Genomics, Randox Laboratories). При­ме­ня­ет­ся мик­ро­чип Cartesian про­из­вод­ст­ва BioSource для муль­ти­плек­с­ной (до 36) де­тек­ции ци­то­ки­нов (чув­ст­ви­тель­ность ме­нее 100 пкг/мл). В по­след­ние го­ды ак­тив­но ве­дут­ся ра­бо­ты по раз­ра­бот­ке би­о­чи­пов (им­му­но­чи­пов) для им­му­но­ло­ги­чес­кой ди­аг­нос­ти­ки ин­фек­ци­он­ных за­бо­ле­ва­ний че­ло­ве­ка, в час­т­нос­ти ви­рус­ных ге­па­ти­тов С и В и вну­т­ри­ут­роб­ных ин­фек­ций. В ЦНИИ Эпи­де­ми­о­ло­гии Рос­пот­реб­над­зо­ра соз­дан но­вый скри­нин­го­вый и под­твер­ж­да­ю­щий тест для се­ро­ло­ги­чес­кой ди­аг­нос­ти­ки ВИЧ-ин­фек­ции (раз­дель­ное опре­де­ле­ние ан­ти­тел к ВИЧ 1,2 и ан­ти­ге­на р24 ВИЧ 1) в фор­ма­те им­му­но­чи­па на по­вер­х­нос­ти слай­дов с аль­де­гид­ным по­кры­ти­ем.

Тех­но­ло­гии и услу­ги ге­но­ди­аг­нос­ти­ки

Ге­но­ти­пи­ро­ва­ние – ком­п­лекс ла­бо­ра­тор­ных про­це­дур, направ­лен­ных на по­лу­че­ние ин­фор­ма­ции о ге­не­ти­чес­ком ста­ту­се ин­ди­ви­ду­у­ма. По­ка­за­ни­я­ми к ис­сле­до­ва­нию мо­гут быть при­над­леж­ность к груп­пе рис­ка, се­мей­ный ха­рак­тер или ра­нее на­ча­ло за­бо­ле­ва­ния, а так­же то­ле­ран­т­ность к те­ра­пии. Ге­не­ти­чес­кое тес­ти­ро­ва­ние для вы­яв­ле­ния пред­рас­по­ло­жен­нос­ти к раз­лич­ным за­бо­ле­ва­ни­ям на­зва­но ве­ли­чай­шим из­об­ре­те­ни­ем 2008 го­да (Time, January 11, 2009).

В США ге­не­ти­чес­кое тес­ти­ро­ва­ние на­след­ст­вен­ной пред­рас­по­ло­жен­нос­ти в 2010 го­ду при­ме­ня­лось к 213 за­бо­ле­ва­ни­ям: ди­а­бет 1 и 2 ти­па, ин­фаркт ми­о­кар­да, фиб­рил­ля­ция пред­сер­дий, рак тол­с­то­го ки­шеч­ни­ка, лег­ких, мо­лоч­ной же­ле­зы, прос­та­ты, рас­се­ян­ный скле­роз, де­ге­не­ра­ция сет­чат­ки, гла­у­ко­ма, тром­бо­фи­лия, ге­мох­ро­ма­тоз, бо­лезнь Кро­на, ожи­ре­ние и дру­гим.

Ге­не­ти­чес­кое тес­ти­ро­ва­ние, по-ви­ди­мо­му, ни­ког­да не ста­нет про­стой об­лас­тью при­ме­не­ния в ме­ди­ци­не, для ус­пеш­но­го его про­дви­же­ния не­об­хо­ди­ма ре­кон­ст­рук­ция вза­им­ных ожи­да­ний вра­чей и па­ци­ен­тов. Ре­зуль­та­ты ге­не­ти­чес­ко­го тес­ти­ро­ва­ния вмес­те с фе­но­ти­пи­чес­ки­ми мар­ке­ра­ми мо­гут уже се­год­ня быть учте­ны в пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ном прог­но­зе, ко­то­рый всег­да бу­дет носить ве­ро­ят­ност­ный ха­рак­тер. В 2009 го­ду раз­ра­бо­та­на ACCE мо­дель про­цес­са оцен­ки ге­не­ти­чес­ких тес­тов: Analytic validity – ана­ли­ти­чес­кая ар­гу­мен­ти­ро­ван­ность: как точ­но и на­деж­но тест из­ме­ря­ет ге­но­тип, Clinical validity – кли­ни­чес­кая дос­то­вер­ность: на­сколь­ко еди­но­об­раз­но и точ­но тест опре­де­ля­ет или пред­ска­зы­ва­ет про­ме­жу­точ­ные или кли­ни­чес­кие по­след­ст­вия, Clinical utility – кли­ни­чес­кая по­лез­ность: на­сколь­ко ве­ро­ят­но тест су­щес­т­вен­но улуч­шит ре­зуль­та­ты ле­че­ния па­ци­ен­тов и Etical, legal, social implications – эти­чес­кие, юри­ди­чес­кие и со­ци­аль­ные во­про­сы, ко­то­рые мо­гут воз­ник­нуть в свя­зи с ис­поль­зо­ва­ни­ем тес­тов. Важ­ность вве­де­ния про­цес­са оцен­ки ге­не­ти­чес­ких тес­тов свя­за­на с тем, что не бо­лее 30–38% име­ю­щих­ся утвер­ж­де­ний о зна­чи­мых ге­не­ти­чес­ких ас­со­ци­а­ци­ях яв­ля­ет­ся на са­мом де­ле ис­тин­ны­ми, а боль­шая часть ис­тин­ных ге­не­ти­чес­ких ас­со­ци­а­ций пред­став­ля­ет со­бой эф­фек­ты не­боль­шой ве­ли­чи­ны с рис­ка­ми 1,1–1,5 (т.е. 10–15% от­но­си­тель­но­го уве­ли­че­ния ве­ро­ят­нос­ти раз­ви­тия за­бо­ле­ва­ния). Лю­бой от­дель­ный по­ли­мор­физм обыч­но объ­яс­ня­ет толь­ко 1–8% от об­ще­го рис­ка за­бо­ле­ва­ния в по­пу­ля­ции. Но ад­ди­тив­ный эф­фект не­сколь­ких та­ких фак­то­ров рис­ка мо­жет со­став­лять до 20–70% об­ще­го рис­ка, об­ус­лов­лен­но­го ге­не­ти­чес­ки­ми фак­то­ра­ми в слу­чае рас­прос­т­ра­нен­ных бо­лез­ней.

В по­след­нее вре­мя в ря­де стран воз­ник­ла ме­ди­цин­ская услу­га ге­не­ти­чес­ко­го тес­ти­ро­ва­ния по за­ка­зу (direct to consumer testing) и ком­па­нии пре­до­став­ля­ю­щие та­ко­го ро­да сер­вис: 23 andme, deCODEme, Navigenetics, Pathway Genomics, Gene Essences, ла­бо­ра­то­рия РЕЮНИ и дру­гие.

Воз­ник­но­ве­ние бла­го­да­ря ус­пе­хам ме­та­бо­ло­ми­ки. ге­но­ми­ки, про­те­о­ми­ки, био­ин­фор­ма­ти­ки и сис­тем­ной био­ло­гии пре­дик­тив­ной и пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ной ме­ди­ци­ны от­кры­ло воз­мож­нос­ти бо­лее ран­не­го воз­дей­ст­вия на ор­га­низм по­тен­ци­аль­но­го па­ци­ен­та для сво­ев­ре­мен­ной кор­рек­ции воз­мож­но­го па­то­ло­ги­чес­ко­го про­цес­са еще на до­кли­ни­чес­ком уров­не. При­чем в ос­но­ву но­вой ме­ди­цин­ской стра­те­гии до­кли­ни­чес­ко­го вы­яв­ле­ния по­тен­ци­аль­ных фар­ма­ко­ло­ги­чес­ких ми­ше­ней мо­гут быть по­ло­же­ны прин­ци­пы фар­ма­ко­кор­рек­ции и фар­ма­коп­ре­вен­ции. Не­об­хо­ди­мо соз­да­ние прин­ци­пи­аль­но но­вых ди­аг­нос­ти­чес­ких ал­го­рит­мов, преж­де все­го муль­ти­фак­тор­ных за­бо­ле­ва­ний: сер­деч­но-со­су­дис­тых, он­ко­ло­ги­чес­ких, эн­док­рин­ных и дру­гих. Дол­ж­ны быть най­де­ны но­вые би­о­мар­ке­ры, ко­то­рые мо­гут пред­ска­зы­вать мо­мент на­ча­ла кли­ни­чес­кой ма­ни­фес­та­ции за­бо­ле­ва­ния, тя­жесть про­те­ка­ния, воз­мож­ность хро­ни­за­ции и ин­ва­ли­ди­за­ции па­ци­ен­тов. Ре­ше­ние ука­зан­ных за­дач по­тре­бу­ет раз­ра­бот­ки прин­ци­пов ин­тер­пре­та­ции ре­зуль­та­тов до­кли­ни­чес­ко­го тес­ти­ро­ва­ния и по­яв­ле­ние ме­ди­цин­ских кон­суль­тан­тов, ко­то­ры­ми мо­гут стать вра­чи ла­бо­ра­тор­ной ме­ди­ци­ны. Не­об­хо­ди­мо соз­да­ние со­вре­мен­ных про­грамм для под­го­тов­ки та­ких спе­ци­а­лис­тов ла­бо­ра­тор­ной, пре­дик­тив­ной и пер­со­на­ли­зи­ро­ван­ной ме­ди­ци­ны в ВУЗах: врач кон­суль­тант па­ци­ен­тов груп­пы рис­ка. При ре­ше­нии ука­зан­ных за­дач ме­ди­ци­на ста­нет по на­сто­я­ще­му про­фи­лак­ти­чес­кой и пар­ти­си­па­тор­ной. т.е. ос­но­ван­ной на ра­бо­те с па­ци­ен­том, разъ­яс­не­нию ему со­сто­я­ние его здо­ро­вья и воз­мож­ные рис­ки.