+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

Современные возможности лабораторной диагностики пневмоцистной пневмонии (ПЦП)

Автор: Р.А. Юсупова
Место работы: Центр по профилактике и борьбе со СПИД г. Алматы

Пневмоцистная пневмония – ПЦП – согласно определению ВОЗ, относится к первой группе СПИД-индикаторных заболеваний, которые присущи только тяжелому иммунодефициту, при СД 4 менее 200. Занимает ведущее место среди микозов в группе возбудителей оппортунистических инфекций, ассоциирующихся с развитой стадией ВИЧ-инфекции, рассматривается как суперинфекция (Белозеров, 2000).

Первичное инфицирование Р. jiroveci происходит в раннем детстве: 2/3 здоровых детей имеют антитела к Р. jiroveci к 2-4 годам. ПЦП наиболее частая СПИД-индикаторная патология среди детей – 34%, чаще всего развивается у детей первого года жизни – 57-72% случаев (СДС, 1995). В Европе у 760 пациентов, которым одновременно были установлены диагноз ВИЧ и СПИД, наиболее частой оппортунистической инфекцией была ПЦП (Мussini, 2008).

У взрослых ПЦП является следствием реактивации латентной инфекции, примерно у половины больных в клинике доминирует пневмоцистная пневмония (Змушко Е.И., Белозеров Е.С., 2000). В 90% случаев ПЦП регистрируется у пациентов с уровнем СД 4 < 200 клеток/мл, при поздней диагностике ПЦП летальность составляет 40%, своевременно начатое лечение снижает летальность на 25%.

Традиционно возбудителем ПЦП считали Pneumocystis carinii, которую относили к простейшим, но благодаря анализу ДНК, выяснилось, что микроорганизм представляет собой необычный тип дрожжеподобных грибов (Edman, 1988, Thomas, 2004). В 1990-х гг. было установлено, что для каждого хозяина, будь то мышь, крыса, обезьяна или человек, патогенен свой вид пневмоцист. Также выяснилось, что микроорганизм P.carinii, впервые описанный в 1910 году, для человека совсем не патогенен, а вызывает заболевание только у крыс.

Патогенный для человека вид пневмоцист назван Pneumocystis jiroveci, в честь чешского паразитолога Отто Йировеца, впервые описавшего этот микроорганизм как причину заболевания человека (Hoffmann, Jurgen, 2012).

Из названия пневмонии было убрано слово carinii, но английская аббревиатура осталась прежней «РСР» (Stringer, 2002).

Возбудитель ПЦП – P.jiroveci – условно-патогенный почкующийся дрожжевой гриб. Это внеклеточный паразит со строгим тропизмом к легочной ткани, в просвете альвеол пневмоциста осуществляет весь жизненный цикл. В цикле развития пневмоцисты выделяют вегетативную форму (трофозоит), предцисту и цисту с внутрицистными тельцами.

Рис.1. Жизненный цикл P.jiroveci

Современные возможности лабораторной диагностики пневмоцистной пневмонии (ПЦП)

Инфекционная единица – спорозоит, имеет тонкую капсулу, может быть круглой или серповидной формы, в ткани легкого легко превращается в трофозоит, который размножается делением. При световой микроскопии ее ошибочно можно принять за дрожжи или эритроциты.

Трофозоиты – клетки размером 1-8 мкм, покрытые тонкой оболочкой. Их форма разнообразная и мобильная (овальная, амебоподобная и др.) Она зависит от формы структур, к которым они прилегают. От поверхности трофозоита отходят микровыросты и длинные отростки в виде филоподий. За их счет пневмоцисты соединяются между собой и прикрепляются к клеткам хозяина. Ядро ограничено двумя мембранами. В цитоплазме выявляются митохондрии, свободные рибосомы, мелкие и крупные вакуоли, полисахариды, капли липидов. Иногда встречаются сдвоенные клетки, что может свидетельствовать о делении или копуляции. По данным электронно-микроскопических исследований, трофозоиты плотно прилегают к альвеолоцитам первого порядка. Филоподии могут углубляться в клетку легкого хозяина, не разрывая ее оболочку. Одновременно мембрана альвеолоцита может входить в тело трофозоита, не повреждая его. Физиологический контакт возбудителя с телом хозяина осуществляется через систему микропиноцитарных пузырьков.

Предцисты – овальные клетки диаметром 2-5 мкм, лишенные пелликулярных выростов. В них происходит деление ядер.

Цисты – округлой или овальной формы, размером 3,5-10 мкм, иногда до 30 мкм. Они покрыты плотной трехслойной оболочкой и внешней мембраной. В цитоплазме содержится от 1 до 8 внутрицистных телец, которые выходят в просвет альвеолы после разрыва оболочки цисты. Пустые цисты имеют неправильную форму, чаще в виде полумесяца, иногда в них выявляются внутрицистные тельца. Размер последних 1-2 мкм. Пелликула внутрицистных телец вновь образуется после выхода из разрушенной цисты. Они становятся внеклеточными трофозоитами и начинают новый раунд жизненного цикла.

Эпидемиология ПЦП

Передача инфекции происходит воздушно-капельным путем. Циркуляция возбудителя среди людей происходит без дополнительных хозяев, т.е. строгий антропоноз. Источником инфекции является как больной ПЦП, так и здоровый носитель, в том числе могут быть и медицинские работники. Входные ворота – дыхательные пути. Путь передачи – воздушно-капельный. Фактор передачи – мокрота, слизь верхних дыхательных путей. Спонтанное носительство – является обычным явлением. Пневмоцисты широко распространены среди многих видов диких, домашних животных и людей (до 10% здоровых людей являются носителями пневмоцист). По морфологическим признакам пневмоцисты от различных животных почти идентичны. Иммунологические, цитохимические и генетические методы исследований последних лет свидетельствуют об отличиях между пневмоцистами, выделенными от различных видов животных. Антитела, которые образуют пневмоцисты у одного вида животных, перекрестно не реагируют с антигенами пневмоцист других видов животных. Хромосомы пневмоцист от человека, мышей, хорьков сходны по размерам, но имеют индивидуальный кариотип. В экспериментальных условиях попытки передачи пневмоцист от человека и различных видов животных, даже иммунодефицитным, закончились неудачей. Это свидетельствует о строгой видовой специфичности P.jiroveci.

Классическую триаду симптомов пневмоцистной пневмонии знает каждый врач: сухой кашель, субфебрильная температура, одышка при физической нагрузке. Типичное подострое течение пневмоцистной пневмонии позволяет отличить ее от бактериальной пневмонии, для которой характерны кашель с мокротой, высокая лихорадка и боль, одышка менее вероятна. У пациентов с пневмоцистной пневмонией часто обнаруживается кандидозный стоматит.

Диагностика пневмоцистоза только по клиническим признакам затруднительна из-за отсутствия патогномоничных симптомов. Нередко несколько недель и даже месяцев пневмоцистная пневмония остается нераспознанной. Стандартное обследование малоинформативно для диагностики пневмонии. До 20% больных имеют невыраженную (стертую) клинику и рентгенологическое обследование не выявляет патологии. В типичных случаях при рентгенографии обнаруживают диффузное и симметричное интерстициальное воспаление с очагами инфильтрации. Такие же признаки поражения легких наблюдают при цитомегаловирусной пневмонии, микоплазменной пневмонии, вирусных и бактериальных пневмониях, аспергиллезе, лимфогенном распространении опухолей и др.

Практически всегда есть дыхательная недостаточность, которую можно выявить, определив газы артериальной крови. При ПЦП повышается активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), по величине этого показателя с некоторой долей допущения можно судить о прогнозе заболевания: высокая активность ЛДГ является неблагоприятным признаком и в некоторой степени отражает тяжесть ПЦП.

В последнее время появились новые методы диагностики ПЦП, такие как выявление специфических антител и измерение уровня S-аденозил-метионина – вещества, необходимого для жизнедеятельности пневмоцист, которое они не способны вырабатывать самостоятельно. По результатам исследований выявлено, что у больных ПЦП уровень S-аденозил-метионина существенно снижен (Skelly, 2008).

В настоящее время описано много методов определения пневмоцист или их маркеров в исследуемом материале. Для диагностики ПЦП применяют паразитологические, иммунологические и молекулярно-биологические методы. Диагностику пневмоцистной пневмонии начинают с исследования слюны. Если Р.jiroveci не обнаруживают, прибегают к более сложным методам. Окончательный диагноз ставят при выделении из легких цист и трофозоитов.

Материалом для исследования могут быть: мокрота, лаважная (промывная) жидкость бронхов, мазки-отпечатки, трахеальный аспират, биопсийный секционный материал легких и других внутренних органов, кожи, ликвора и др. При диссеминированном пневмоцистозе маркеры (Аг, Ат или ДНК) возбудителя могут выявляться, кроме перечисленного выше, в сыворотке крови.

При получении мокроты, существуют определенные трудности, так как кашель у больных ПЦП, как правило, не продуктивный. Пневмоцисты редко присутствуют в мокроте и слизи трахеи, поэтому исследование нативной мокроты, как правило, неинформативно.

Спонтанно отхаркиваемая мокрота имеет низкую чувствительность (18-30%) и не должна рассматриваться в качестве материала для лабораторного анализа на пневмоцисты.

Индуцированое отделение мокроты достигается с помощью ингаляции (например, через небулайзер) гипертонического 3% раствора NaCl в течение 10-15 минут. Пневмоцист в мокроте, даже при использовании солевой ингаляции, обнаруживают не более чем у половины больных. Чувствительность метода – 50-60%. Индуцированное отделение мокроты обладает такими несомненными достоинствами, как низкая стоимость и высокая безопасность для пациента. Однако, при этом пациенты в большом количестве выделяют пневмоцисты во внешнюю среду, подвергая, тем самым, опасности окружающих.

С целью получения адекватных материалов для исследования, обычно используют более инвазивные методы: фибробронхоскопия с БАЛ и/или трансбронхиальной биопсией – это наиболее используемые методы для получения материала для исследования.

Бронхоскопия с бронхоальвеолярным лаважем (БАЛ) – во всем мире считается оптимальным методом для диагностики ПЦП. Для этого, через бронхоскоп (введенный в периферический бронх, обычно правой средней доли) дробно, по 20-30 мл, инстиллируется 100-250 мл стерильного физиологического раствора. После введения каждой порции содержимое аспирируется. Когда объем аспирата достигает 50 мл, полученный материал центрифугируется, осадок окрашивается. Информативность БАЛ достигает 84-97%, также он позволяет своевременно выявить сопутствующие инфекции (цитомегаловирусную, пневмококковую), но при этом следует учесть, что БАЛ усилит проявления легочной недостаточности (Лыкова, 2001).

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ:

Паразитологический метод – окрашивание препаратов:

Обычные методы окраски не дают возможности достоверно определять пневмоцисты из-за невосприимчивости полисахаридов клеточной оболочки. Поэтому методы окраски пневмоцист делятся на 2 группы:

1-ая группа – красители, дифференцирующие внутреннюю структуру клетки без окрашивания оболочки, применяют азур-эозин по Романовскому, гематоксилин-эозин по Граму. Это скрининговые окраски, требующие дополнительной верификации.

2-ая группа красителей воспринимаются и удерживаются нейтральными полисахаридами оболочки пневмоцист. Вследствие этого визуализируется клеточная стенка возбудителя без определения внутренней структуры. Окраска производится толуидиновым синим, кристаллическим фиолетовым, калькофлуором белым метенамином серебра по Гомори-Грохоту, окраска по Бауэру и др.

Современные возможности лабораторной диагностики пневмоцистной пневмонии (ПЦП)
Современные возможности лабораторной диагностики пневмоцистной пневмонии (ПЦП)
Современные возможности лабораторной диагностики пневмоцистной пневмонии (ПЦП)

Для повышения эффективности лабораторных исследований в последнее время предлагаются усовершенствованные методы окраски, в частности, двойное окрашивание материала, которое позволяет визуализировать как содержимое пневмоцист, так и оболочку. Это окрашивание по Гомори и Гимзе, по Романовскому и толуидиновым синим или метиленовым синим. При окрашивании по Романовскому-Гимзе можно выявить все формы пневмоцист. Наиболее характерной структурой является «розетка», состоящая из 8 грушевидных спорозоитов, каждый из которых имеет размеры 1-2 мкм, объединенных в цистоподобную структуру диаметром 7-10 мкм. Более ранние стадии развития представлены 1-4 ядрами в слизистом шаровидном образовании. При интенсивной окраске по Романовскому-Гимзе ядра окрашиваются в красный цвет, цитоплазма в голубой, оболочка должна быть красно-фиолетовой. Специальные окраски (по Гомори, толуидиновым синим) облегчают интерпретацию полученных результатов, но дороги и трудоемки.

По данным разных авторов, эффективность исследования окрашенных мазков из свободно отходящей мокроты составляет 33-74%; из мокроты индуцированной ингаляцией солевых растворов – 18-86%; из мокроты аспирированной бронхоскопом – 60%; биопсийного и аутопсийного материала – 100%.

Широкое колебание показателей эффективности обнаружения пневмоцист в биологических субстратах свидетельствует о том, что они зависят от вида материала, способа его отбора, условий хранения до исследования, методов окраски, а также от навыков и квалификации исследователя (микроскописта).

Более информативными и чувствительным являются метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) и полимеразно-цепная реакция (ПЦР).

Иммунологические методы.

Данные методы основаны на выявлении специфических антител (Ат) или растворимых антигенов (Аг) пневмоцист в биологических субстратах. В основе лежит реакция Аг-Ат. Чаще всего используют реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) или реакцию непрямой имунофлюоресценции (РНИФ), когда Ат или Аг возбудителя коньюгированы с флюорохромами. Для выявления антипневмоцистных моно- или поликлональных Ат используют иммуноблотинг (ИБ), иммуноферментный анализ (ИФА) или иммуноэлектрофорез. Моноклональные непрямые тест-системы для выявления пневмоцист в мазках методом РИФ выпускают «Диагностик Пастер» (Франция) и «Медак Диагностика» (Германия).

Чувствительность метода – 71-97%, специфичность – 30-40% (Кишкун, 2006).

В ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России разработаны и выпускаются три вида диагностикумов пневмоцистоза: «Пневмоцисто Флюо АГ диагностика», для проведения непрямой реакции флюоресценции для выявления всех форм пневмоцист в мазках из мокроты; Набор реагентов «Пневмоцисто Стрип» для выявления специфических антител классов IgM и IgG к антигену Pneumocystis carinii в сыворотках крови.

Выявление Ат типа IgM или 4-х кратное нарастание титра Ат типа IgG в парных сыворотках, отобранных с интервалом 10-14 дней, свидетельствует об остром процессе. Необходимо помнить, что титры Ат у больных с различными формами иммунодефицита (в том числе, при ВИЧ-инфекции) значительно ниже, чем у прочих лиц. У пациентов с клиническим СПИДом, с почти разрушенной иммунной системой, Ат могут вообще исчезать, несмотря на наличие тяжелого инфекционного процесса.

Молекулярно-биологические методы — ПЦР

Первостепенное место в лабораторной диагностике пневмоцистоза принадлежит выявлению возбудителя, его Аг или ДНК в исследуемых субстратах. Наиболее перспективным для эффективной диагностики ПЦП является метод амплификации фрагментов генов пневмоцист. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) выявляет участки ДНК возбудителя в любых биологических субстратах: мокроте, лаважной жидкости, оральных смывах, крови и др. Методу присуща 100% эффективность, высокая чувствительность и специфичность. Особенно важным является то, что ПЦР дает возможность надежно определять возбудителя в материале, который отобран у больных с помощью неинвазивных методов (мазки из зева, оральные смывы, свободно отходящая мокрота и др.). На территории РФ определение ПЦП методом ПЦР в течение 7 дней проводят не только Центры по профилактике и борьбе со СПИД, но и коммерческие медицинские центры, где обследуются не только ЛЖВ, но и люди с иммунодефицитом и др.

В тоже время из-за высокой чувствительности ПЦР возникают трудности в интерпретации результатов. Учитывая имеющиеся данные, в настоящее время необходима разработка количественных критериев оценки выделения пневмоцист в биологических субстратах.

Выводы:

n  Исследование мокроты связано с определенными сложностями, начиная с методов забора материала, так и с методами окраски материала, дифференциальной диагностики;

n  Для пациента с ПЦП, учитывая дыхательную недостаточность,  наиболее удобно использование неинвазивных методов отбора материала (мазки из зева, сыворотка крови);

n  Исследование сывороток крови на ИФА, обнаружение антител класса М или 4-х кратное возрастание IgG, дает врачу информацию об остром процессе;

n  Для наиболее достоверной, качественной диагностики удобнее ПЦР-диагностика;

n  Применение комплекса диагностических методов позволяет проводить прижизненную диагностику ПЦП, за которой следует адекватная терапия;

Рекомендации:

n  Необходима регистрация тест-наборов для диагностики ИФА, ПЦР на территории РК;

n  Обучение специалистов лаборатории методам диагностики;

n  Лицам, живущим с ВИЧ, обязательно проводить лабораторную диагностику пневмоцистоза, т.е. определение антител к P.jiovecii методом ИФА или ПЦР диагностики;

n  Для ЛЖВ необходим регулярный мониторинг антител классов М и G, каждые полгода и исследование парных сывороток с интервалом 10-14 дней, при снижении СД 4 до 300кл/мл;

n  Использование количественного метода ПЦР, в процессе лечения пневмоцистоза, может быть индикатором качества лечения.