СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИИ РОДА STREPTOCOCCUS

В последние два десятилетия существенно изменились наши представления о жизнедеятельности микроорганизмов  медицинского значения. До настоящего времени не было предпринято попытки совокупного изучения многочисленных видов стрептококков  медицинского и ветеринарного значения. Весьма полезной в научно-практическом отношении, на наш взгляд,  представляется систематизация различных видов стрептококков по разным критериям. Дискуссии на тему, должен ли лабораторный специалист интерпретировать результаты лабораторных исследований или только лишь предоставлять их клиницисту, являются беспредметными. Лабораторный специалист должен постоянно оценивать, насколько эффективно используется в клинике лабораторная информация, каков ее вклад в окончательный итог лечения пациента [1]. В этой связи вопросы идентификации клинических изолятов до вида главная составляющая успеха бактериологического исследования биосубстрата.

Стрептококковые инфекции продолжают оставаться в числе наиболее острых проблем здравоохранения во всех странах мира. Трудно найти раздел медицины, в котором не встречались бы заболевания, вызванные условно-патогенными стрептококками [2].

Целью данного бактериологического исследования, как одного из методов доказательной медицины, являлось совершенствование этапа идентификации и дифференциации клинически значимых изолятов стрептококков, причастных к возникновению инфекционно-воспалительных процессов дыхательных путей.

Материалы и методы. Бактериологическим методом за период с 2003 по 2008 гг. на базе кафедры микробиологии проводились исследования 1240 образцов, был накоплен «банк» клинических штаммов, отобрано из них 849, выделенных из мокроты (поиск этиопатогена ориентирован на клинический диагноз индивидуальной картой  стационарного больного, либо направлением лечащего амбулаторного пациента). Предварительная подготовка проб проводилась общепринятым способом (гомогенизация стеклянными бусами).

Нами использованы среды выделения и дифференциации: колумбийский агар для грамположительных кокков М560, сердечно-мозговой агар  М1036,  азидный бульон с этилвиолетом М426. За основу был взят количественный метод посева и учета. Критерием в оценке этиологической значимости явилась обсемененность 106 и ³ КОЕ в 1мл мокроты. Для выделения и идентификации культур использовались питательные среды в соответствии с приказом №535 МЗ РК от 22 апреля 1985 г.

Результаты и обсуждения

Количественный метод по-прежнему не теряет актуальности и позволяет определить изменения нормального соотношения видов микробов в микробиоценозе, диагностировать развитие дисбактериоза, а с другой стороны, количественные показатели  облегчают фактическое слежение (так называемый мониторинг) за динамикой инфекционного процесса [3, 4]. К числу фенотипических классификаций можно условно отнести и классификацию (группировку), проведенную в руководстве по определению бактерий  Берджи (1997 г.), когда 38 видов стрептококков разделены на 4 группы, выделенные по разным критериям: «пиогенные»,  «оральные», «анаэробные»,  лишь к 4-й группе  отнесены другие виды стрептококков, не имеющие единых критериев для их выделения [5]. Различные виды стрептококков, многие из которых специалисты причисляют к нормофлоре, играют неодинаковую роль в патологии человека, что свидетельствует об их различии по патогенности. Проблема патогенности всегда привлекала пристальное внимание специалистов разной профессиональной ориентации. Она остается актуальной и по сей день, особенно в связи с угрозой возникновения ВБИ. При этом и в настоящее время отсутствует согласованное определение понятия патогенности в отношении бактерий рода  Streptococcus. Многие авторы полагают, что безусловные патогены располагают всеми факторами патогенности, которые обуславливают возникновение у практически здоровых людей. В то время как условные патогены этими факторами не обладают, поэтому способны вызывать инфекцию лишь при определенных условиях (нарушение целостности кожных покровов, недостаточности иммунитета, попадании в  обычно стерильные полости и др). К истинно патогенным стрептококкам, считают Покровский В. И, Брико Н. И., Ряпис Л. А (2006 г.), необходимо отнести S. pyogenes, S. pneumoniae, S. agalactiae,  отличающиеся высокой медицинской значимостью, а вызываемые ими болезни МКБ 10 имеют самостоятельные рубрики [6,7,8]. А как же другие стрептококки? Какова их клиническая значимость?

В отношении принципов микробиологической диагностики СГА (S. pyogenes), СГВ (S. agalactiae), СГД альфа-гемолитические (S. pneumoniae)  известно сходство на этапе искусственного культивирования.  Меджидов М. М с соавторами в 2007 г.  разработал питательную среду — сухой бульон обогащения для выделения из клинического материала стрептококков, обладающий хорошими ростовыми свойствами, накопительным эффектом и высокой степенью ингибиции микробных ассоциантов [9].  Между тем, практика показывает, что основа колумбийского агара М560 для кровяного агара (КА) высокопитательна, но при этом нами была использована без добавления крови в качестве среды общего назначения. Ее можно обогатить внесением крови или сыворотки, использование бараньей крови обеспечивает наилучшие результаты для тестирования стрептококков группы А.  Слабокислые значения рН (6,8±0,2) помогают различать гемолитические реакции и способствуют росту на данной среде пневмококков и пиогенных стрептококков, позволяя изучить альфа- и бета-гемолиз. В нашей работе КА при культивировании стрептококков занимала одно из ключевых мест. Сердечно-мозговой агар, тоже с 1% агар-агара, также  нами использован для культивирования  стрептококков и других этиопатогенов при обследовании клинического материала. Этот агар является высокопитательным и способствует получению обильного роста широкого круга микроорганизмов, особенно стрептококков. Питательность данной среды можно повысить добавлением крови, а селективность – введением различных антибиотиков. Сердечно-мозговой агар служит средой общего назначения для первичного выделения аэробных бактерий из клинического материала.

Клинический интерес представляли и другие резидентные представители стрептококков, которые на этапе культивирования требовали соблюдения определенных условий для обеспечения их жизнеспособности. Соответственно, этап выделения культуры требует учета этих  нюансов.

Приоритетным направлением совершенствования диагностики стрептококковой инфекции на сегодняшний день является оптимизация этапа идентификации. В этой связи, известен способ идентификации стрептококков коммерческой пластины «СТРЕПТО-тест 16»,  фирмы PLIIVA Lachema, когда используется набор, содержащий 16 биохимических тестов, помещенный в стрип микротитровальной пластинки. Однако недостаток этого способа заключается в том, что для идентификации стрептококков нужна дорогостоящая компьютерная программа БАКТ. В практических бактериологических лабораториях в настоящее время воспроизведение этого теста не представляется возможным по причине отсутствия должного финансирования.

Многолетний опыт работы с клиническим материалом позволил нам предложить алгоритм идентификации стрептококков до вида с межвидовой дифференциацией, ограничиваясь минимальными финансовыми затратами, который в 88,9% случаев оказался эффективным в отношении клинических изолятов 849 культур, из которых стрептококки составляли 63,4%.  Нами была  разработана «схема-ключ», которая позволяла осуществить  идентификацию стрептококков посредством изучения комплекса минимального количества фенотипических признаков, определить видовую принадлежность изучаемого изолята и одновременно отдифференцировать между видами.

Методологически результат достигался путем определения таксономической принадлежности до вида клинического изолята рода Streptococcus по 11 фенотипическим признакам:

• способности роста при различных температурных режимах (+10^оС, +45^оС),
• гемолитической активности,
• чувствительности к бацитрацину,
• оптохину,
• ферментации раффинозы, маннита, гиппурата, инулина, аргинина,
• образованию ацетоина.

Начало видовой идентификации стрептококков включает определение отношения клинического изолята к температурному режиму +45^оС, что позволяет на этом этапе установить 2 группы, включающие виды, неспособные расти  при  +45^оС и сохраняющие  жизнеспособность при этом же режиме.

Способ идентификации и дифференциации первой группы, в которую вошли 8 видов  (S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. milleri, S. mitior, S. mitis, S. mutans, S. Sanguis),  включает оценку отсутствия или наличия гемолиза, а также типа гемолиза для дифференциации между собой трех образовавшихся подгрупп. Штаммы, образующие ß-гемолиз на основании чувствительности к бацитрацину позволяют различить 2 вида: S. agalactiae, S. pyogenes. Три представителя, не образующие гемолиз (S. agalactiae, S. milleri. S. Mutans), дифференцируются последовательно по трем тестам: ферментация инулина, раффинозы, гиппурата, в результате чего их идентификация заканчивается. Из клинических изолятов, образующих α-гемолиз (S. pneumoniae, S. mitior, S. mitis, S. Sanguis), чувствительность к оптохину позволяет идентифицировать S. pneumoniae. Из оставшихся трех видов по образованию ацетоина в реакции Фогес-Проскауэра (VP) идентифицируется S. mitior. Из этого же числа по наличию роста при  +10^оС возникает возможность идентификации S. mitis. Отсутствие роста при +10^оС с дальнейшим декарбоксилированием аргинина на следующем этапе позволяет дифференцировать S. sanguis от S. mitior (Фигура 1).

Способ идентификации и дифференциации другой условной группы клинических изолятов,  сохраняющих  жизнеспособность при режиме +45^оС, в которую вошли 6 видов  (S. milleri, S. mitior, S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S. salivarius), включает подразделения по оценке отсутствия или наличия гемолиза, а также типа гемолиза. Наличие ß-гемолиза характерно для S. milleri. Четыре вида способны образовывать α-гемолиз: S. mitior, S. mitis, S. sanguis, S. salivarius.  По образованию ацетоина в реакции VP различают 2 подгруппы.  S. Mitior и S. salivarius входят в одну из подгрупп, а по ферментации инулина идентификация для обоих заканчивается. Представителей другой подгруппы (S. mitis, S. mitior, S. Sanguis) последовательно дифференцируют между собой по наличию роста при +10^оС, декарбоксилированию аргинина. Заключительный этап межвидовой дифференциации стрептококков группы с отсутствием гемолиза (S. salivarius. S. milleri, S. mutans) основывается на ферментации клиническими изолятами раффинозы, с последующей дифференциацией двух видов по ферментации маннита. 

Пример

Из мокроты после соответствующего культивирования на кровяном агаре выделен клинический изолят, идентификация которого первоначально проводилась по морфологическим и тинкториальным особенностям – грамположительные кокки, диплококки 1-4 мкм диаметром шарообразной или вытянутой формы. По отрицательному каталазному тесту был отнесен к семейству Streptococcaceae. Тест на прихотливость, т. е. отсутствие роста на мясопептонном агаре, позволил определить принадлежность изучаемого изолята к роду Streptococcus. Отсутствие роста при +45^оС, позволило предположить один из восьми родов: S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. milleri, S. mitior, S. mitis, S. mutans, S. sanguis. Наличие α-гемолиза, учтенного на кровяном агаре, сузило поиск среди 4 видов: S. pneumoniae, S. mitior, S. mitis, S. Sanguis. Дифференциация по чувствительности к оптохину позволила исключить принадлежность к S.pneumoniae. Отсутствие образования ацетоина, а также отсутствие роста при +10^оС позволило дифференцировать между двумя видами: S. mitior, S. sanguis. Заключительный этап идентификации включал изучение процесса декарбоксилирования аргинина, который позволил отнести клинический изолят  к S. sanguis.

Таким образом, применение предлагаемой «схемы-ключа» позволяет в относительно короткий промежуток времени с малыми экономическими затратами проводить идентификацию стрептококков до вида по 11 признакам, ограничиваясь в отдельных случаях, как в выше описанном примере, лишь шестью информативными ключевыми тестами.

«Схема-ключ» позволяет проводить идентификацию бактерий рода Streptococcus до вида для осуществления эффективной бактериологической диагностики как инфекционных, так и оппортунистических заболеваний. Она может служить основой для рациональной идентификации стрептококков посредством изучения минимального количества фенотипических признаков даже для лабораторий со средним материально-техническим оснащением.

Литература

1. Меньшиков В.В. Лабораторная профессия в современных условиях //Клиническая лабораторная диагностика.- 2007.- № 4. — с. 41-43.
2. Брико Н.И. Тенденции развития эпидемического процесса и профилактика болезней, вызываемых стрептококками серогруппы А.//Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2001. — № 2.- с. 42-45; Брико Н.И., Филатов Н.Н, Журавлев М.В, Еровиченков А.А, Бражников А.Ю. Клинико-эпидемиологическая характеристика стрептококковой (группы А) инфекции современном этапе// Терапевтический архив. 2002. — № 11.- с. 26-31.
3. Меньшиков В.В. Клиническая аналитика. Том 1V. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории.-М.: Агат-Мед. — 2003. – 816. —  с. 342-350.
4. Усвяцов Б.Я, Хуснутдинова Л.М, Паршута Л.И. и др.. Роль факторов персистенции и вирулентности при микроэкологических изменениях в организме человека. ЖМЭИ., 2006 — №4. — с. 58-65.
5. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П.Смита и др.  9-е изд. М., Мир. – 1997. – с. 24.
6. Покровский В.И. Медицинская микробиология.  М., Учебное пособие. – 1999. – с.  1183;
7. Ряпис Л.А., Брико Н.И., Дмитриева Н.Ф. и др. Пульс-электрофорез стрептококков серогруппы А, изолированных в Москве  // Ж. «Микробиол.» –  2006. – № 7. – с. 33-37.
8. Брико Н.И.,  Филатов Н.Н.,  Журавлев М.В. и др.  Клинико-эпидемиологическая характеристика стрептококковой (группы А) инфекции на современном этапе // Тер. Архив.  –2002. – № 11. – с. 26-31.
9. Меджидов Ш.М, Осокина Т.И, Астарханова Л.А, Белялова З.Ш. Сухая питательная среда обогащения для выделения стрептококков (стрептококк-бульон)// Ж. «Микробиол.» — 2007. — №1. — с.9-12.