+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

Саркомы мягких тканей: возможности иммунофенотипирования на цитологических препаратах в сравнении с гистологией

Автор: Л. Ю. Кислицина, Ю. К. Батороев
Место работы: Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования, ректор – д.м.н., проф. В. В. Шпрах, кафедра онкологии, зав. – д.м.н., проф. В.В. Дворниченко

Резюме
Показана принципиальная возможность иммунофенотипирования в цитологических мазках для дифференциальной диагностики, определения гистогенеза, оценки их пролиферативной активности первичных и метастатических опухолей мягких тканей. Приведен анализ результатов исследования 55 наблюдений. Достоинством являются короткие сроки ответа и простота выполнения процедуры. Результаты оценены в сравнении с иммуногистохимическим исследованием на парафиновых срезах указанных опухолей. 

Ключевые слова: цитологическая диагностика, иммуноцитохимия, саркомы мягких тканей.
Введение
Опухоли мягких тканей характеризуются большим числом онконозологических форм и вариантов. Поэтому морфологическое распознавание их является одним из наиболее трудных разделов онкоморфологии [5,7]. Центральной проблемой первичной цитологической диагностики опухолей мягких тканей на начальном этапе становится получение адекватного материала для исследования, а также определение злокачественной природы и гистогенеза опухоли [1,4,9]. При наличии адекватного материала показатели чувствительности и специфичности аспирационной тонкоигольной пункции по данным литературы достигают 96% [7].

Нами изучен материал отпечатков и пунктатов у 427 пациентов с опухолями и опухолеподобными поражениями мягких тканей за пять лет. Процент малоинформативного материала достиг 27,8%. В 154 (50,3%) случаях был выставлен диагноз мягкотканной саркомы или метастатического поражения мягких тканей, что подтверждено гистологическим исследованием. В 126 (41%) случаях доброкачественных опухолей или опухолеподобных поражений дано описательное или утвердительное заключение о доброкачественном характере процесса, в 19 (5,7%) случаях саркоматозных поражений при наличии материала не был установлен правильный цитологический диагноз (случаи синовиальной саркомы, фибросаркомы, злокачественные опухоли периферического нерва, лимфомы, поражения мягких тканей при остеогенной саркоме), в 9 (3%) случаях доброкачественных опухолей диагноз злокачественной опухоли был ложноположительным. Таким образом, показатели чувствительности и специфичности составили 89 и 93,3% соответственно.
Иммунофенотипирование (ИФТ) опухолей в современной онкоморфологии имеет чрезвычайно важное значение [7,9,10]. 

Рационально используя методы и алгоритм иммунофенотипирования, в морфологических препаратах можно определить гистогенез опухолей мягких тканей, провести дифференциальную диагностику [2,3]. Это позволяет повысить точность и надежность цитологических заключений [5,7,9]. В большинстве морфологических лабораторий такие исследования проводятся на гистологических препаратах из срезов парафиновых блоков или замороженных кусочков тканей. Однако для парафиновой заливки требуется несколько дней, кроме того, предварительная фиксация препаратов формалином изменяет структуру белка, что требует перед исследованием восстанавливать антигенные детерминанты по специальному протоколу [3]. 

Исследование замороженных срезов для опухолей мягких тканей вообще затруднено и далеко не всегда позволяет оценить гистовариант опухоли перед ИФТ. Если сравнить возможности иммуноцитохимического метода (ИЦХ) при аспирационной пункции и в мазках-отпечатках из биоптатов и иммуногистохимического (ИГХ), то преимущества ИЦХ несомненны: пункционная биопсия под контролем компьютерного томографа (КТ) или ультразвукового сканера – более простая процедура, чем открытая биопсия. Она позволяет получить полноценный клеточный материал; при неудачной пункции и попадании в участок некроза, стромы или окружающих тканей процедуру можно повторить; нет необходимости фиксировать материал в формалине, проводить процедуру демаскировки антигенов.

Цели и задачи исследования
Используя материал, полученный при тонкоигольной аспирационной пункции, мазки-отпечатки из биоптатов, полученных во время биопсии или из фрагментов удаленных во время плановых операций опухолей мягких тканей, мы попытались определить возможности ИФТ на цитологических мазках. Известно, что воспроизводимость методики в цитологических мазках ограничена по времени из-за контакта материала с атмосферным кислородом [2]. 

В парафиновых же блоках нет контакта тканей с кислородом, поэтому срезы, полученные из архивного материала даже после долгих лет хранения, позволяют проводить полноценное ретроспективное изучение белкового состава [3]. Мы ставили задачу проведения в ряде случаев определения гистогенетической принадлежности опухолей мягких тканей, а также определения пролиферативной активности. Кроме того, мы хронометрировали скорость окраски от момента получения материала, а также попытались определить продолжительность сохранности мазков-отпечатков (в днях) при различных условиях и пригодности их для иммунофенотипирования. Результаты окраски на цитологических мазках сравнивали с результатами окраски гистологических срезов с парафиновых блоков этих опухолей.

Материалы и методы исследования
Иммуноморфологическому исследованию было подвергнуто 5 метастазов в мягкие ткани из легких (n=2), молочной железы (n=2), толстой кишки (n=1), лимфом с поражением мягких тканей (n=7), меланомы (n=1), 45 случаев первичных сарком мягких тканей: различных вариантов рабдомиосаркомы (n=6), злокачественой фиброзной гистиоцитомы (n=7), лейомиосаркомы (n=6), внескелетной хондросаркомы (n=2), внескелетной саркомы семейства Юинга (n=5), липосаркомы (n=5), синовиальной саркомы (n=2), эпителиоидной саркомы (n=2), фибросаркомы (n=7). Использовались пунктаты, мазки-отпечатки, полученные из биопсийного и операционного материала, нанесенные на адгезивные стекла (DAKO), обработанные силаном. Мазки высушивали на воздухе. Чтобы убедиться в наличии клеток опухоли, один мазок-отпечаток окрашивался обзорными красителями (азур-эозином или гематоксилин-эозином). Предназначенные для исследования мазки заворачивали в фольгу и хранили в холодильнике при температуре -20°. 

В работе были использованы моноклональные кроличьи и мышиные антитела (DAKO): к белку Ki67 (клон MIB-1), протеину S100, панцитокератину, цитокератинам простых эпителиев, эпителиального мембранного антигена (ЭМА), РЭА, виментину, CD45, СD30, СD3, СD20, СD10, СD79ầ, TdT, СD99, хромогранину, гладкомышечному актину, десмину миоглобину, миогенину, НМВ-45, MelanA [4,7,9]. 

Для визуализации им¬мунной реакции использовали систему LSAB+ Detection System (DAKO) согласно инструкции, пероксидазную активность выявляли с помощью 3,3-диаминобензидина (DAB), цитопрепараты до¬крашивали гематоксилином Майера и заключали в бальзам.
Экспрессия маркера оценивалась способом полуколичественной оценки [6]. Реакция считается отрицательной при полном отсутствии или экспрессии антигена менее 5% опухолевых клеток, слабоположительной – от 5-10% до 24% клеток, умеренно положительной – в 25-75%, выраженной – более чем в 75% клеток. Подсчет иммунопозитивных кле¬ток проводили в областях с максимальным прояв-лением диаминобензидина на 200 опухоле¬вых клеток на микроскопе Axioplan.

Для оценки пролиферативной активности в цитологических мазках подсчитывалось количество окрашенных ядер на 500 клеток, с последующим вычислением индекса пролиферации (ИП) в процентах. В дальнейшем результаты иммуноцитохимического исследования ретроспективно сопоставлялись с результатами иммуногистохимического исследования. 
Результаты 
Алгоритм дифференциальной диагностики злокачественной опухоли мягких тканей включал:
1) определение высокой и низкой степеней дифференцировки на основании полуколичественной оценки, указанной в таблице 1;

Таблица 1 

Саркомы мягких тканей: возможности иммунофенотипирования на цитологических препаратах в сравнении с гистологией

2) выделение основных групп опухолей в зависимости от варианта строения и клеточного фенотипа:

• с обильным миксоидным веществом;
• веретеноклеточные опухоли;
• опухоли преимущественно из округлых клеток;
• полиморфноклеточные опухоли;
• опухоли из клеток эпителиоидного типа;
• из зрелых клеток,

3) после постановки уверенного или предположительного диагноза первичных злокачественных опухолей мягких тканей с использованием оригинальной цитологической классификации опухолей мягких тканей [5], созданной на основе Международной гистологической классификации ВОЗ 2002, определения дифференциального ряда, панель включала использование диагностических антител.
Окраска препаратов с целью дифференциальной диагностики показала, что во всех мягкотканных опухолях, независимо от гистотипа и степени злокачественности, имеет место позитивное окрашивание с виментином.

Липосаркома 
Изучено 5 случаев липосаркомы, из них – 4 случая миксоидного варианта и 1 случай полиморфноклеточного. Реакция с виментином позитивна во всех случаях, в 2-х случаях миксоидной липосаркомы получена позитивная реакция с протеином S100 (слабое диффузное окрашивание). 

Лейомиосаркома
Изучено 6 случаев, из которых в 4-х был полиморфноклеточный вариант, в 2-х – веретеноклеточный. Во всех 6 случаях утвердительный диагноз лейомиосаркомы был установлен при положительной реакции с виментином, десмином и гладкомышечным актином; кроме того, в одном случае была положительная реакция с протеином S100. Реакция с эпителиальными маркерами не проводилась.

Рабдомиосаркома
Из 4-х случаев в 2-х был вариант эмбриональной рабдомиосаркомы, в одном полиморфноклеточный, в одном – альвеолярный вариант. Во всех 4 случаях обнаружена позитивная реакция с виментином и десмином. Реакция с десмином и миогенином обнаружена только в эмбриональном и альвеолярном вариантах (3 случая). Позитивная реакция с CD99 была отмечена в некоторых клетках эмбриональной рабдомиосаркомы. В случаях полиморфноклеточного варианта рабдомиосаркомы в цитологических препаратах не было реакции с миогенином, в отличие от ИГХ исследования.
Злокачественная фиброзная гистиоцитома (ЗФГ)
Была представлена 7 наблюдениями. В 5 из них был диагностирован полиморфноклеточный вариант, в 2-х – гигантоклеточный. Позитивное окрашивание с виментином получено во всех 7 случаях, в 3-х случаях полиморфноклеточного варианта клетки опухоли давали положительную окраску с CD68.

Фибросаркома
Изучено 7 случаев, в которых обнаружена положительная реакция только с антителами к виментину. Экспрессия десмина, гладкомышечного актина, протеина S100, ЭМА отсутствовала. Во всех случаях фибросаркомы проведено определение пролиферативной активности с антителами к Ki67. Индекс мечения (ИМ) во всех 7 случаях был выше 50%.
Внескелетная миксоидная хондросаркома
В 2 случаях обнаружена экспрессия виментина и протеина S100. Реакция с антителами к синаптофизину была негативной. 
Мягкотканая саркома семейства Юинга 
Представлена 5 наблюдениями. Во всех случаях была положительная реакция с СD99 и виментином; ШИК-реакция выявила в цитоплазме клеток опухоли «сливные» озера гликогена.
Синовиальная саркома
Изучено 2 случая, которые представлены бифазным вариантом. Клетки опухоли экспрессировали виментин, ЭМА, реакция с цитокератинами выявлена в некоторых клетках.

Эпителиоидная саркома
Изучено 2 случая, в клетках опухоли обнаружена отчетливая реакция с панцитокератином и виментином.
Для целей дифференциальной диагностики первичных и метастатических опухолей мягких тканей в панель антител были включены маркеры эпителиальной дифференцировки (цитокератины, антиген эпителиальных мембран), кластеры лейкоцитарной дифференцировки (CD45, CD3, CD20, CD79ậ) и маркеры клеток меланомы. Так, для отличия метастазов колоректального рака применялись антитела к РЭА, цитокератинам 8 и 18. Для верификации метастаза плоскоклеточного рака (из легкого) использовался коктейль цитокератинов А1/А3, для мелкоклеточного рака легкого – цитокератины в сочетании с хромогранином и синаптофизином. С целью исключения лимфомы с первичным поражением мягких тканей использовались антитела к общему лейкоцитарному антигену и кластерам дифференцировки лейкоцитов. Диагностировать метастазы рака молочной железы помогло выявление рецепторов стероидных гормонов, экспрессия которых выявлялась как в клетках метастатических опухолей, так и в клетках первичного очага. 

Таким образом, проведенное исследование показывает, что метод иммуноцитохимического исследования позволяет проводить дифференциальную диагностику для определения гистогенеза первичной опухоли мягких тканей, выявлять метастатический характер поражения.

По результатам проведенного ИЦХ исследования сарком мягких тканей 
можно сделать вывод о неспецифичном иммунопрофиле таких опухолей как липосаркома, мезенхимальная хондросаркома и синовиальная саркома. Правильная интерпретация результатов иммуноцитохимического исследования сарком мягких тканей возможна только с предварительной оценкой клеточного и структурного фенотипа опухоли с применением обзорных окрасок (азур-эозин, гематоксилин-эозин) и учетом клинико-рентгенологических данных. 

При выявлении белков пролиферативной активности в цитологических мазках хорошо определяется и предложенная методика подсчета окрашенных ядер на 500 клеток, сопоставимая с гистологическим методом и позволяет адекватно оценить пролиферативную активность. 
К преимуществам иммуноцитохимической методики можно отнести:
1. Возможность получения ответа в кратчайшие сроки – при необходимости уже через 2-3 часа после взятия материала при биопсии или операции возможно не только сделать выводы о наличии опухоли, но и дать полноценное морфологическое заключение о ее гистотипе и гистогенезе, основанное на иммунодиагностике, что максимально приближает ответ к точности гистологического диагноза; 
2. Более простая по сравнению с иммуногистохимическими методиками процедура окраски, где не требуется восстановления антигенных детерминант из-за отсутствия формалиновой фиксация материала, что исключает артефакты, связанные с ней (изменение третичной структуры белка). 

К недостаткам относят:
1. Более короткие сроки сохранности цитологических мазков из-за повреждающего действия атмосферного кислорода – оптимальные сроки использования мазка, хранящегося при комнатной температуре, составляют 7-10 дней;
2. Невозможность оценки экспрессии белков внеклеточного матрикса на цитологических мазках ввиду случайного распределения.
Таким образом, использование ИЦХ-метода в диагностике мягкотканых сарком позволяет расширить возможности современных морфологических методов исследования, на дооперационном этапе определить гистогенез и выявить агрессивные свойства опухоли.

Литература: 
1. Батороев Ю.К. Опухоли мягких тканей: пересмотр классификации ВОЗ (1994), новые нозологические единицы, современные методы диагностики, клинико-морфологические подходы в работе практического онколога // Новости клинической цитологии России. – 2003. – №7(1–2) – с. 26-27
2. Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорнов В.А., Крячок И.А. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей (руководство). Киев: Морион, – 2003. – 155 с.
3. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань, – 2004. – 287 с.
4. Скляренко Л.М., Глузман Д.Ф., НадгорнаяВ.А., ИвановскаяТ.С., Коваль С.В., Полудненко Л.Ю., Климнюк Г.И., Балицкая О.В. Иммуноцитохимическая диагностика сарком из малых округлых клеток // Онкология. – 2005. – Т.7, №4. – с. 327-329
5. Шапиро Н.А., Батороев Ю.К, Кислицына Л.Ю. Цитологическая диагностика опухолей мягких тканей (цветной атлас). – М.: Репроцентр. – 2009. – 220 с.
6. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистохимия (методические рекомендации). – Санкт-Петербург, 2002
7. Aсkerman M., Domanski H.A. The Cytology of Soft tussue Tumors (monographs in Clinical Cytology). – Karger, Basel – Freiburg – Paris – London – NewYork – Bangalore – Bangkok – Singapore – Tokyo – Sydney, 2003. – p. 124
8. Ganjei-Azar P, Nadji M. Color Atlas of Immunocytochemistry in Diagnostic Cytology. – Springer-Science: Business Media, – 2007. – p. 308
9. Guiter G.E., Gatscha R.M., Zakowski M.F. Thin Prep vs. Conventional smears in fine-needle aspirations of sarcomas: //Am J. Diagn Cytopathol. – 1999. – Vol.21, №5. – р. 351-354
10. Rangdaeng S., Truong L.D. Comparative immunohistochemical staing for desmin and muscle-specific actin. A study of 576 cases// Am J. Clin Pathol. – 1991. – № 96 – р. 32-45.