Роль электрофореза в диагностике множественной миеломы

Электрофорез принадлежит к базовым методам клинической биохимии и широко используется при исследовании нарушений белкового спектра сыворотки крови, мочи и цереброспинальной жидкости.

Основной принцип электрофоретического метода исследования заключается в том, что находящиеся в растворе молекулы, располагающие электрическим зарядом, под действием сил электрического поля смещаются в сторону противоположно заряженного электрода. Скорость миграции вещества в среде с одной и той же силой электрического поля, зависит от размера частиц и их электрического заряда. В случае белковых молекул, благодаря их амфотерным свойствам, направление и скорость смещения во многом зависит от рН среды, в которой происходит миграция. Заряд различных белков в растворах с одинаковым рН зависит от аминокислотного состава, так как диссоциация белковых цепей приводит к образованию групп, имеющих положительный или отрицательный заряд. Под влиянием сил электрического поля компоненты разгоняемой системы распределяются согласно их заряду, приобретая соответствующую скорость движения, т.е. происходит электрофоретическое разделение. Внедрение электрофоретических «носителей» привело к улучшению технологий и одновременно к упрощению фракционирования. В качестве «носителей» используются фильтровальная бумага, ацетат целлюлоза, различные гели (полиакриламид), агароза и др. При этом во время элекрофореза, наряду с разделением частиц согласно их зарядам, вступает в силу так называемый «молекулярно ситовой эффект», когда гелевая структура ведет себя по отношению к ионам как фильтр. Ионы, превышающие ее пористость не проходят или проходят очень медленно, а более мелкие ионы быстрее проникают через поры носителя. Таким образом, скорость передвижения зависит не только от заряда иона, но и от величины пор геля, формы пор, величины движущихся ионов, взаимодействия между матрицей геля и движущимися ионами (адсорбция и др.) [2].

История создания электрофореза начинается с 1807 года, когда профессор Московского Государственного Университета Ф. Рейс открыл такие явления, как электроосмос и электрофорез. Однако практическое использование этого процесса в биологии и медицине началось значительно позже и связано с именем лауреата нобелевской премии по химии Арне Тизелиусом, который в 30-е годы прошлого столетия разработал  метод электрофореза в свободной жидкости и сконструировал прибор для электрофоретического разделения и анализа смеси белков методом свободных, или подвижных границ. Основным недостатком этого метода являлось выделение тепла при прохождении через жидкость электрического тока, это препятствовало четкому разделению фракций и приводило к размыванию границ между отдельными зонами. В 1940 г. Д. Филпот предложил использовать колонки с градиентом плотности буферных растворов, а в 50-е гг. метод был усовершенствован и создан прибор для электрофореза в градиенте плотности. Однако, метод был не совершенен, т.к. после отключения электрического тока, образовавшиеся в ходе электрофореза зоны – «расплывались». Последующие достижения в электрофорезе связаны со стабилизацией зон в твердой поддерживающей среде. Так в 1950 г. в качестве твердого носителя стали использовать фильтровальную бумагу, в 1955 г. было предложено использовать крахмал, а уже в 1957 г. Кон предложил использовать в качестве твердого носителя пленки ацетатцеллюлозы, которые до настоящего времени остаются одним из наиболее часто используемых носителей при клинических исследованиях.

Примерно в это же время был разработан метод, в котором в качестве основы использовалась агароза. В 1960 г. был разработан метод капиллярного электрофореза и лишь в 1989 г. был создан и внедрен в практику первый анализатор, в основе которого был заложен метод капиллярного электрофореза [3].  

Основное значение электрофореза — обнаружение аномалий белкового профиля и, начиная с 60-х годов прошлого столетия, электрофорез белков сыворотки является популярным скрининговым методом  лабораторных исследований. На сегодняшний день известно уже более 150 индивидуальных сывороточных белков и значительную часть из них можно определить количественно с помощью различных современных иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных, нефелометрических и иммунотурбидиметрических методов. Но при всей информативности и доказательности этих анализов пока они в основном малодоступны из-за сравнительной дороговизны, а также требуют наличия в лаборатории дорогостоящего оборудования (нефелометр). Вместе с тем типовые сдвиги белкового состава сыворотки крови можно определить гораздо более доступным электрофоретическим методом, который к тому же позволяет «одним взглядом» оценить общую картину белкового спектра и получить значимую диагностическую информацию [1]. Именно поэтому электрофоретический анализ белков сыворотки и сегодня остается наряду с биохимическим анализом крови популярным скрининговым методом исследования. Так, например, в США, Японии и некоторых странах западной Европы сохранились традиции определение белковых фракций сыворотки крови до проведения биохимического анализа крови. Однако чаще всего электрофорез белков назначают после биохимического и общеклинического анализа крови. Основные критерии для назначения электрофореза следующие:

• Снижение концентрации общего белка в сыворотке крови менее 60 г/л
• Увеличение концентрации общего белка в сыворотке крови более 85 г/л
• Снижение концентрации альбумина в сыворотке крови менее 35 г/л
• Увеличение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) неясного генеза более 25 мм/ч

Электрофорез белков, помогает выявить заболевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразования (множественная миелома), острые и хронические инфекции, генетические поломки и др. Известен ряд своеобразных электрофоретических «синдромов» – типичных картин электрофореграмм, характерных для некоторых патологических состояний. Среди них можно отметить:
1. Моноклональные гаммапатии   — это сборное наименование целого класса заболеваний, при котором происходит патологическая секреция аномальных, измененных по химическому строению, молекулярной массе или иммунологическим свойствам иммуноглобулинов одним клоном плазматических клеток или B-лимфоцитов. Эти иммуноглобулины затем нарушают функции тех или иных органов и систем, например, почек, что и приводит к развитию симптомов заболевания.

2. Острое воспаление с активацией системы комплемента и увеличением синтеза острофазных белков (a₁-антитрипсина, гаптоглобина, фибриногена и др.). Оно проявляется увеличением доли a₁— и a₂-глобулинов и может быть подтверждено измерением СОЭ, исследованием концентрации С-реактивного белка, фибриногена (в динамике) и других острофазных белков.
3. Хроническое воспаление с усилением синтеза ряда острофазных белков, а также иммуноглобулинов; проявляется умеренным возрастанием a₂— и b-глобулинов, повышением g-глобулинов и некоторым снижением альбумина. Подобные отклонения могут наблюдаться при хронических инфекциях, коллагенозах, аллергии, аутоиммунных процессах и при малигнизации.
4. Тяжелые заболевания печени сопровождаются снижением синтеза альбумина и a‑глобулинов, что и отражается на электрофореграммах. При хронических гепатитах и циррозах печени возрастает как относительное, так и абсолютное количество g-глобулинов (b- и g-фракции могут сливаться из-за накопления IgA), причем превышение g-глобулинов над альбуминами является весьма неблагоприятным прогностическим признаком.
5. Нефротический синдром сопровождается увеличением фильтрации белков в почках и селективной протеинурией – потерей с мочой большого количества альбумина и части низкомолекулярных глобулинов (a₁-антитрипсина, трансферрина). При этом в печени усиливается синтез более крупных протеинов семейства a₂-глобулинов (макроглобулин, апо-В), которые накапливаются в крови и формируют картину со значительным снижением альбумина и повышением a₂-глобулинов.
6. Нарушение всасывания или значительная потеря белков возможна как при нефротическом синдроме, так и при массивных ожогах, синдроме Лаэлла, патологии желудочно-кишечного тракта и т.д. В последнем случае снижается абсолютное содержание общего белка и особенно альбумина, а на протеинограмме оказывается уменьшенной доля альбумина при относительно равномерном возрастании всех глобулинов. Введение белковых препаратов (иммуноглобулины, альбумин или плазма крови) в ходе лечения больных немедленно отражается на электрофоретической картине, что позволяет следить за динамикой потерь или выведения поступивших белков.
7. Тяжелый иммунодефицит врожденного или приобретенного генеза обычно сопровождается выраженным снижением g-глобулиновой фракции. При этом желательно провести дополнительное количественное определение IgG, IgA и IgM. [1]

В связи с тем, что клинический электрофорез является «золотым стандартом» для выявления моноклональных гаммапатий хотелось бы более подробно остановиться именно на диагностике этого заболевания.

Моноклональные гаммапатии — это группа злокачественных новообразований из клеток B-лимфоцитарного ряда, морфологическим субстратом которых являются клетки, продуцирующие моноклональный иммуноглобулин (парапротеин).

Количество впервые выявленных случаев множественной миеломы в США в 2010 году по данным Американского Противоракового Общества составило 20 180 случаев. Количество смертей от данного заболевания – составило 10 650. Средний возраст мужчин на момент постановки диагноза составил – 62 года (75% были старше 70 лет), женщин – 61 год (79% были старше 70 лет). Заболеваемость — 7,8 на 100 тыс. населения [4].

В Великобритании в 2007 году было зарегистрировано 4040 случаев впервые выявленной множественной миеломы. Заболеваемость 6,5 на 100 тыс. населения [5].

В Республике Беларусь (по данным Белорусского канцер-регистра (БКР) в 2007 г. зарегистрировано 39003 случая заболеваний с впервые установленным диагнозом, что соответствует регистрации в среднем 106,9 случаев заболевания в день.

В то же время в России в 2007 году по данным Вестника РОНЦ РАМН  зарегистрировано всего лишь 2 372 первичных случаев множественной миеломы, заболеваемость составила 1,7 на 100 тыс. населения [6].

Столь существенная разница в заболеваемости множественной миеломы в США, странах Европы и России обусловлена отсутствием в нашей стране единого алгоритма в диагностике данного заболевания, отсутствия скрининговых программ.

Объем диагностических исследований при подозрении на множественную миелому, рекомендуемый Национальным Институтом Рака в США (National Comprehensive Cancer), наиболее влиятельной онкологической организацией в Америке включает следующие диагностические мероприятия:

• Общий анализ крови (с обязательным подсчетом формулы крови);
• Развернутый биохимический анализ крови (разделение белков сыворотки крови на фракции, креатинин, мочевина, электролиты, печеночные ферменты, уровень бета-2-микроглобулина);
• Иммунофиксационный электрофорез (для установления типа парапротеинемии);
• Электрофорез белков мочи и имунофиксация белков мочи (суточная моча) для диагностики болезни легких цепей.

Следует отметить, что ведущее значение в данных рекомендациях придается методу электрофореза и иммунофиксации белков сыворотки крови и мочи для выявления моноклонального компонента (парапротеина). Наличие в сыворотки крови или мочи парапротеина является наиболее частым и наиболее ранним лабораторным проявлением множественной миеломы. Для его выявления проводят электрофорез белков, а затем  иммунофиксационный электрофорез сыворотки и мочи. При моноклональных гаммапатиях содержание гаммаглобулинов в сыворотке обычно возрастает, и на электрофореграмме в этой зоне обнаруживается острый пик, называемый М-градиентом (от слова «моноклональный»). Величина М-градиента отражает массу опухоли. М-градиент является надежным, и достаточно специфичным для массовых обследований опухолевым маркером. Также иммунофиксационный электрофорез показан также больным, у которых высока вероятность множественной миеломы, но обычный электрофорез не выявил никаких дополнительных полос.

Легкие цепи (каппа или лямбда) в сыворотке крови выявляются только методом иммунофиксациии при условии, что их концентрация превышает 10 норм. Поэтому всегда одновременно с электрофорезом сыворотки крови необходимо выполнять электрофорез белков мочи [7].

С учетом того, что множественная миелома – заболевание, которое в большинстве случаев диагностируется у людей старше 50 лет, и важности диагностики данного заболевания на ранней субклинической стадии (средняя продолжительность заболевания при I стадии – 62 мес., при III – 29 мес.), в США и ряде стран Европы существуют скрининговые программы для лиц старше 50 лет. Сущность таких программ заключается в ежегодном выполнении обязательного перечня скрининговых лабораторных исследований, в которых электрофорез белков сыворотки крови и мочи включен в один ряд с общим анализом крови, мочи и биохимическими исследованиями.

В ряде случаев М-градиент может наблюдаться у практически здоровых людей. В этих случаях речь идет о моноклональной гаммапатии неясного генеза. Данное состояние встречается намного чаще – у 1 % людей старше 50 лет и почти у 10 % старше 75 лет. Лечения данное состояние не требует, но требует постоянного наблюдения, так как  у таких пациентов существует вероятность заболевания множественной миеломой.  Наблюдение должно включать регулярные осмотры с измерением уровня М-градиента (парапротеина) в сыворотке методом электрофореза; при низком риске прогрессирования интервалы между осмотрами должны составлять от 6 до 12 месяцев.

За последние годы, достигнут существенный прогресс в лечении данного заболевания. Пятилетняя безрецидивная выживаемость увеличилась с 24 % в 1975 году до 35% в 2003 году [5]. Данные успехи можно объяснить с одной стороны, разработкой новых современных режимов полихимиотерапии, в ряде случаев с проведением высокодозной полихимиотерапий с алло-трансплантацией костного мозга, а с другой стороны, адекватной диагностикой и разработкой единых критериев оценки ответа на проводимую терапию, а так же мониторированием уровня концентрации парапротеина в сыворотке крови и/или мочи методом электрофореза  с целью определения остаточной болезни.

Таким образом, в настоящее время ни у одной из исследовательских групп, занимающихся диагностикой и лечением множественной миеломы, не остается сомнений в чрезвычайной важности проведения анализа разделения белковых фракций сыворотки крови и проведения иммунофиксационного электрофореза, как единственного, наиболее точного и доступного метода для диагностики и мониторирования множественной миеломы.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Гильманов А.Ж., Саляхова P.M. Электрофорез сывороточных белков: современные возможности анализа, http://med.com.ua
2. Сергеева Н.А./ Электрофорез в современном диагностическом процессе // Клин. лаб. диагн. – 1999. — № 2. — С. 25-32.
3. Шевченко О.П., ДолговВ.В., Олефиренко Г.А./Электрофорез в клинической лаборатории. Белки сыворотки крови/ Из-во: «Триада», г. Тверь, 2006 г., 160 с.
4. Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. et al. (2010) Cancer statistics, 2010. CA: A Cancer Journalfor Clinicians, 60, 277–300
5. Brenner H, Gondos A, Pulte D. Recent major improvement in long-term survival of younger patients with multiple myeloma, Blood.2008 Mar 1;111(5):2521-6.
6. Давыдов М. И., Аксель Е. М./Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2007 г.// Вестник РОНЦ Том 20, №3 (77), прил .1, июль-сентябрь 2009 г., 158 с.
7. National Comprehensive Cancer Network/ Clinical Practice Guidelines in Oncology// Multiple Myeloma, version 1.2011, 52 pg.