+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

Роль ПЦР в скрининге населения Южно-Казахстанской области на вирусные гепатиты (генотипирование гепатита С) на базе областной клинической больницы за 2012-2014 гг.

Автор: Е. М. Файзулина, С. С. Мустафина
Место работы: Западно-Казахстанский медицинский колледж, г. Уральск (Казахстан)


Резюме

Согласно Постановлению Правительства Республики Казахстан от 04 декабря 2009 года №2018 «Об утверждении перечня социально значимых заболеваний, опасных для окружащих», вирусные гепатиты В и С являются социально значимыми заболеваниями.
Результаты проведенного скрининга демонстрируют, что полимеразная цепная реакция (ПЦР) является идеальным методом для диагностики скрыто, бессимптомно и хронически протекающих инфекций. ПЦР — самый «используемый» метод в гепатологии, венерологии, урологии для точной диагностики.

Summary
According to the Government of the Republic of Kazakhstan dated December 4, 2009 №2018 «On approving the list of socially significant diseases and dangerous to others» viral hepatitis B and C are socially significant diseases.
The results of the screening show that the polymerase chain reaction (PCR) is an ideal method for the diagnosis of hidden, asymptomatic and chronic infections occurring. PCR — the «used» method in hepatology, Venereology, Urology for accurate diagnosis.

Ключевые слова: ПЦР, скрининг, скрыто текущие инфекции, ДНК-матрица, амплификация, элонгация, праймер, контрольная проба, денатурация – двухцепочечной ДНК-матрицы, ОКБ-областная клиническая больница, ЮКО — Южно-Казахстанская область
Keywords: PCR screening, hidden recurrent infections, template DNA, amplification, elongation, primer control sample, denaturation — a double-stranded DNA template, OKB-Regional Hospital, SKO — South Kazakhstan region

Актуальность
В связи с тем, что у значительного числа лиц с хронической инфекцией гепатита С развивается цирроз или рак печени, ранняя диагностика гепатита С очень актуальна. Антивирусное лечение приносит успех в 50–90% случаев, в зависимости от лечения и по имеющимся данным также сокращает развитие рака и цирроза печени.
Вирус гепатита С (ВГС) впервые был идентифицирован в 1988 году, когда группа исследователей во главе с М. Houghton и Choo Q.L, применив новые молекулярно-биологические методы исследования, клонировала и секвенировала геном вируса. Частица вируса гепатита С имеет сферическую форму со средним диаметром около 50 нм. Попытки визуального обнаружения и изучения строения вируса гепатита С предпринимались с момента открытия вируса, однако до сих пор отсутствуют хорошо документированные результаты этих исследований, что, возможно, связано с трудностями накопления вирусных частиц в необходимых количествах.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей рибонуклеиновых кислот (РНК-изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира и в процессе заболевания от одного и того же пациента) выявил основную особенность этого вируса — высокую гетерогенность РНК. 
В настоящее время определено 6 основных генотипов и свыше 100 субтипов ВГС. Генотипы 1а, 1в, 2а, 2в, 2с и 3а составляют более 90% HCV-изолятов, полученных в Северной и Южной Америке, Европе, России, Китае, Японии, Австралии, Новой Зеландии. Генотипы 4, 5а и 6 соответственно регистрируются в Центральной и Южной Африке, Юго-Восточной Азии. В странах СНГ и в Казахстане зарегистрировано преобладание генотипа 16 (не менее 68,9%).
У больного ВГС циркулирует популяция частиц вируса, у которых геномы отличаются друг от друга на 1-2% (квазиспецифичности) в результате мутаций, накапливающихся во время инфекции и/или попавших в организм пациента при заражении. Эти мутантные формы могут способствовать более активной репликации или могут помогать вирусу уклоняться от иммунного ответа организма и потенциально влиять на исход острой инфекции, различия в течение заболевания и ответе на интерферонотерапию.

Цель исследования и
методология

Цель скрининга – своевременное выявление РНК вируса гепатита С, определение вирусной нагрузки и генотипа вируса у пациентов, имеющих положительные результаты ИФА.
Исследования проводились методом ПЦР в режиме реального времени с использованием термоциклера Rotor-Gene 6000 наборами реагентов АмплиСенс HCV- FL. 
Полимеразная цепная реакция — широко применяемый как в Казахстане, так и за рубежом метод детекции РНК ВГС. В его основе лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты.
Из исследуемого материала (плазма крови) выделяется РНК ВГС. Учитывая, что нуклеиновая кислота ВГС представлена РНК, а для амплификации необходима молекула кДНК, при помощи фермента обратной транскриптазы происходит образование однонитевых молекул кДНК ВГС. На следующем этапе к определенному участку каждой из цепей к ДНК ВГС присоединяются праймеры — короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям. 

Далее при помощи фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы происходит синтез новых участков ДНК. На завершающем этапе одного цикла реакции, при помощи ДНК-полимеразы происходит синтез новых цепей комплементарных к ДНК ВГС. 
После анализа данных, полученных при исследовании 1037 человек были выявлены положительные результаты РНК гепатита С у 191 человека. Наиболее часто обнаруживается 1b генотип-126 больных (65,9%), реже встречается генотипы 3a-45 больных(23,5%) и 2-20 больных(10,5%).

Выводы
Гепатит С редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами. Чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса 85%, возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С, позволяя:
1) Установить факт инфицированности гепатитом С. Во-первых, это важно при обследовании контактных лиц, так как РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше, чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому при обнаружении антител к вирусу гепатита С рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК, и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.
2) Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК ВГС (при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа ВГС (генотип 1 хуже отвечает на противовирусную терапию по сравнению с генотипами 2 и 3).
3) Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.
4) Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения. 
В заключении необходимо отметить, что сегодня ПЦР является самым чувствительным и специфичным методом прямого обнаружения возбудителей, позволяющим не только устанавливать этиологию заболевания, но и осуществлять контроль за течением инфекционного процесса, оценивать эффективность проводимой терапии.

Литература:

1. Вагорас А., Савичева А., Гален А., Домейка М. «Принципы диагностики вирусных гепатитов» Каунас: Издательство студия «КАТА», 2001. 42 с.
2. Гервазиева В. Б., Самойликов П. В. Взаимодействие вирусов семейства Herpesviridae с иммунной системой человека // Аллергология и иммунология. 2010. № 1. С. 31–41.
3. Гомберг М., Ковалык В. П. Хламидиоз и простатиты // Инфекции, передаваемые половым путем. 2002. № 4. С. 3–9.
4. Гущин А.Е., Рыжих П.Г., Савочкина Ю.А. и др. Диагностика гепатитов с помощью ПЦР в реальном формате «Мультипрайм» // 2011. №4. с. 58–63.
5. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. – Москва: Медицинская книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003. 336 с.
6. Долгих Т.И. Современная лаборатория: диагностический потенциал и мониторинг актуальных инфекционных заболеваний. Омск: 2010. 58 с.
7. Исаков В.А., Архипова Е.И., Исаков Д.В. Выявление генотипа гепатита С: руководство для врачей. СПб.: СпецЛит, 2006. 301 с.
8. Кишкун А. А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2009. 712 с.
9. Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, S. 341—361.
10. Alice Chien, David B.Edgarи John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme ThermophilicThermusaquaticus. JourmalofBacteriology, Sept. 1976, pp. 1550—1557