+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ПЛАЦЕНТЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У ЖИВОТНЫХ ПРИ ГИПОКСИИ

Автор: Утешева Ж.А., Дзоз Л.С., Жиенбаев К.Р., Курманова А.М., Кравцова Н.В., Тохтакулинова Г.К., Сейдахметова З.Ж.
Место работы: Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии МЗ РК, Алматы

Состояние иммунной системы при пренатальной гипоксии является ведущим критерием полноценности гомеостатических механизмов  репродуктивных процессов [1,2,3]. Именно иммунная система обеспечивает поддержание гомеостаза организма плода. Недостаточность тех или иных звеньев иммунитета, может привести к неблагополучному исходу беременности. Кислородная недостаточность способствует  нарушению функций организма, изменению обменных процессов, появлению аномалий развития эмбриона и т.д. На поздних сроках беременности кислородное голодание приводит к задержке роста плода, поражению центральной нервной системы, снижению адаптационных возможностей новорожденного [4,5,6]. Исследование фенотипа лимфоцитов (суммы поверхностных рецепторов клетки, связанных с разными этапами еe развития) [7] в периферической крови и локально в плаценте помогут выявить закономерности формирования адаптации организма к гипоксии при беременности .

Цель: Изучить субпопуляционный состав лимфоцитов при пренатальной гипоксии различной степени тяжести в эксперименте у крыс.

Материалы и метода: Экспериментальные исследования проводились на 50 половозрелых белых беспородных крысах-самках, массой 220-235 г. с 21-22 дневным циклом гестации. Все животные были разделены на три группы: 1) вне беременности – 10 животных; 2) контрольная группа (физиологическая беременность) — 10 животных; 3) основная группа — 30 животных, содержащихся в условиях экспериментальной хронической гипоксии (10 — лeгкой, 10 — средней, 10 — тяжeлой степени). Забор периферической крови и плаценты крыс проводили на 21 день беременности. Пренатальная хроническая гипоксия воспроизводилась путем экспозиции беременной самки крысы в условиях атмосферного воздуха с примесью паров хлористого метилена.

Наличие и степень тяжести гипоксии у экспериментальных животных определяли по методу Назырова А.Т., Исраиловой М.З. по содержанию в крови карбоксигемоглобина и КОС. Экспозиция с 18 по 21 день беременности — гипоксия лeгкой степени, с 16 по 21  — выраженная гипоксия, с 14 по 21  — угрожающее состояние плода. Забор периферической крови осуществляли после дачи эфирного наркоза путeм декапитации животных в стерильные одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА. Гематологические показатели (общее количество лейкоцитов, лимфоцитов) определяли на гематологическом анализаторе. Лимфоциты плаценты крыс выделяли из одного грамма гомогенезированной ткани плаценты, которую фильтровали через 5 слоeв стерильной марли, и далее добавляли 1 мл стерильного физиологического раствора. Идентификацию лимфоцитов осуществляли по общему лейкоцитарному гейту СД45+.

 Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов крови крыс выявляли методом прямой мембранной иммунофлюоресценции на проточном цитометре BD Facs Calibur с применением панели моноклональных антител к поверностным антигенам лимфоцитов крыс: к СД3+-маркеру зрелых Т-лимфоцитов, к СД4+-маркеру хелперно/индукторных Т-клеток, к СД8+-маркеру супрессорно/цитотоксических Т-лимфоцитов, к СД16+-маркеру натуральных киллерных клеток, к СД25+-маркеру £-цепи ИЛ-2, к СД27+-маркеру дифференцировки. Использовали коммерческие наборы реагентов  Fitc labeled anti-rat СД3, СД4, СД8, СД16, а также  PE labeled anti-rat СД25, СД27 (BD Biosciences, США). Достоверность различий определялась по коэффициенту Стьюдента (P<0,05).

Результаты исследования

В результате эксперимента были получены следующие данные. В таблице 1 приведены основные показатели субпопуляционного состава лимфоцитов (относительное  количество) в периферической крови крыс. Содержание в периферической крови СД3+ лимфоцитов при I степени гипоксии не отличалось от данных физиологической беременности (р<0,05), достоверно снижалось  в группе со II степенью гипоксии (р<0,05), и возрастало при III степени гипоксии (р<0,05). По мере тяжести гипоксии в группе крыс со II степенью гипоксии имело место снижение количества СД3+ клеток в сравнении с I степенью, которое повышалось при III степени гипоксии (р<0,05).  Т.е. количество зрелых Т-лимфоцитов значительно отличалось при  II степени гипоксии от данных, полученных от здоровых крыс, в динамике гипоксии имело место уменьшение количества клеток при II степени, повышающееся при III степени гипоксии.

Среди лимфоцитов с фенотипом СД4+ и СД8+, осуществляющих иммунорегуляцию, отмечалось достоверное снижение количества СД4+ лимфоцитов в группе животных с гипоксией I и II степени в сравнении со здоровыми крысами, которое приближалось к контролю при III степени гипоксии. СД8+ клетки, наоборот, при I и II степени гипоксии  были увеличены в сравнении с физиологической беременностью и достоверно снижались при III степени гипоксии (р<0,05). Т.е. хелперно-индукторные Т-лимфоциты, осуществляющие протективный иммунный ответ, при I и II степени гипоксии снижались в сравнении с данными, полученными от здоровых животных, и нормализовались при III степени гипоксии. Супрессорно-цитотоксические Т-клетки при гипоксии I и II степени были заметно увеличены  в сравнении с таковыми у здоровых крыс и снижены при III степени гипоксии. Соответственно, вел себя и иммунорегуляторный индекс (СД4+/СД8+),  который был снижен при I  и  II степени гипоксии, и увеличен при III степени в сравнении с данными, полученными от здоровых крыс с физиологическим течением беременности (р<0,05). В динамике гипоксии, при нарастании  тяжести при II степени в сравнении с I, отмечалось снижение СД4+лимфоцитов и нарастание количества этих клеток при III степени гипоксии (р<0,05). 

Количество СД8+лимфоцитов при III степени гипоксии было снижено в сравнении с I и II степенью (р<0,05) и не различалось между I и II степенью гипоксии. Т.е. в динамике развития гипоксии, при II степени тяжести, шло уменьшение количества циркулирующих в крови хелперно-индукторных и не меняющееся количество супрессорно-цитотоксических Т-лимфоцитов в сравнении с I степенью, а дальше, по мере нарастания гипоксии (III степень), хелперно-индукторные клетки начинали увеличиваться, имея тенденцию к нормализации, а супрессорно-цитотоксические лимфоциты наоборот, еще больше снижались. Т.е. отмечалась разбалансировка иммунокомпетентных СД4+ и СД8+ клеток, обусловленная тяжестью гипоксии. Количество натуральных киллерных клеток СД16+ фенотипа в опытных  со II и III степенью гипоксии группах крыс, было достоверно снижено по сравнению с аналогичными данными, выявленными в группе здоровых и отличалось от показателей, полученных при гипоксии в I группе крыс (р<0,05).

В динамике гипоксии – при II степени тяжести шло уменьшение СД16+ клеток по сравнению с данными, выявленными у опытных крыс с I степенью гипоксии, которое практически не отличалось от показателей, полученных при  III  степени гипоксии (р<0,05). Т.е. количество натуральных киллерных клеток, циркулирующих в крови опытных крыс, не отличалось от данных контроля при I степени гипоксии, было достоверно уменьшено при II степени и практически не менялось при III степени гипоксии. Количество активированных по СД25+ маркеру лимфоцитов резко уменьшалось при I  и  II степени гипоксии в сравнении со здоровыми (р<0,05),  и имело тенденцию к нарастанию показателей при III степени гипоксии. В динамике гипоксии шло нарастание количества СД25+ клеток при III степени  тяжести по сравнению с I и II (р<0,05), а также тенденция статистически недостоверная к увеличению данных при II степени в сравнении с I.  Т.е. при гипоксии шло снижение в циркуляции количества активированных клеток по СД25+ маркеру ранней активации при I и II степени гипоксии, которое при III степени было заметно увеличенным.

Т.е. на системном уровне пренатальная гипоксия вызывала разнотипные нарушения СД25+ рецептора на иммунокомпетентных клетках периферической крови крыс, которые зависели от тяжести гипоксии. Количество лимфоцитов, несущих рецептор СД27, в целом у всех крыс с пренатальной гипоксией, было достоверно меньше аналогичных данных полученных от крыс с физиологической беременностью (р<0,05). У здоровых крыс вне беременности количество СД27 лимфоцитов не отличалось от результатов, полученных при физиологической беременности, составив 36,40±0,47 % и 39,3±1,54 % соответственно. Т.е. пренатальная гипоксия способствовала нарушению дифференцировки Т-лимфоцитов у крыс, вызывая снижение количества лимфоцитов с СД27 маркером, что вызывало серьезные сдвиги в иммунной системе. В зависимости от тяжести гипоксии показатели были достоверно снижены при III степени гипоксии в сравнении со II и I (р<0,05) и не различались между I и II  степенью гипоксии.

Таким образом, исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови крыс при пренатальной гипоксии различной степени тяжести позволило выявить разбалансировку количественных показателей, зависящую от степени тяжести гипоксии. Количество зрелых СД3+ (Т-лимфоцитов) не различалось между здоровыми и больными беременными крысами при I степени гипоксии, достоверно снижалось при II степени гипоксии и увеличивалось при III степени   гипоксии. В динамике гипоксии шло уменьшение количества зрелых СД3+ лимфоцитов при II и нарастание при  III степени   гипоксии. Содержание иммунорегуляторных хелперно-индукторных (СД4+) Т-лимфоцитов снижалось при  I  и  II степени гипоксии в сравнении со здоровыми и нормализовалось при III степени. В динамике гипоксии имело место снижение количества СД4+  клеток, осуществляющих иммунорегуляцию, при II степени гипоксии в сравнении с I, и увеличение числа СД4+ клеток при III степени гипоксии в сравнении со II и I. Количество супрессорно-цитотоксических СД8+ Т-лимфоцитов увеличивалось при I и II степени гипоксии в сравнении с данными полученными при физиологической протекающей беременности и снижалось при III степени гипоксии. В динамике гипоксии СД8+ показатели лимфоцитов не различались при I и II степени гипоксии и достоверно снижались при I  степени гипоксии.

ИРИ был снижен при I и II степени и увеличен при III степени гипоксии в сравнении со здоровыми, а количество натуральных киллерных СД16+ лимфоцитов при I степени гипоксии не отличалось от данных контрольной группы, снижалось при II степени, нормализуясь при III степени гипоксии. В динамике патологии отмечалось уменьшение количества СД16+ клеток при II степени в сравнении с I, далее при III степени гипоксии имела место тенденция к некоторому нарастанию СД16+. Содержание активированных СД25+ лимфоцитов резко уменьшалось при I  и II степенях гипоксии в сравнении со здоровыми и имело тенденцию к нарастанию при III степени гипоксии. В динамике гипоксии показатели СД25+ не различались между I и II степенью гипоксии и были достоверно увеличены при III степени гипоксии по сравнению с I и II. Количество СД27+ лимфоцитов было достоверно снижено при всех степенях гипоксии (I, II, III) в сравнении с аналогичными данными, полученными при физиологической беременности. В динамике гипоксии количество СД27 лимфоцитов было достоверно снижено при III степени гипоксии в сравнении с I  и  II.

Известно, что благоприятный исход беременности во многом определяют факторы иммунитета, участвующие в процессе взаимодействия материнских клеток и трофобласта в децидуальной оболочке, т.е. в месте контакта материнских и плодовых тканей. Была проведена локальная оценка относительного содержания субпопуляций  иммунокомпетентных клеток плаценты крыс (таблица 2). Анализ полученных данных позволил выявить серьезные нарушения количества иммунокомпетентных клеток плаценты крыс при гипоксии различной степени тяжести, отличающиеся от аналогичных данных,  полученных от здоровых животных с физиологическим течением беременности. Так количество зрелых СД3+ клеток у крыс с гипоксией I и II степени превышало аналогичные данные, полученные от контрольной группы животных, и было достоверно меньше у животных с III степенью гипоксии (р<0,05). В динамике гипоксии при I и II степени показатели СД3+ лимфоцитов не выявили достоверных различий между собой, но были снижены при III степени гипоксии (р<0,05). 

Иммунорегуляторные хелперно/индукторные СД4+ и супрессорно/цитотоксические  СД8+ Т-лимфоциты также были увеличены при I и II степени гипоксии в сравнении с данными, полученными при физиологической беременности, и снижались при III степени гипоксии (р<0,05). В динамике гипоксии шло нарастание количества СД4+ и СД8+ лимфоцитов при II степени гипоксии в сравнении с I, и снижение при III степени гипоксии по сравнению с I и II (р<0,05). Количество натуральных киллерных клеток СД16+ фенотипа при гипоксии I, II и III степени было увеличенным по сравнению с данными, выявленными при физиологической беременности (р<0,05). В динамике гипоксии количество СД16+ лимфоцитов снижалось при II степени гипоксии в сравнении с I и оставалось на том же сниженном уровне при III степени (р<0,05). Количество лимфоцитов, несущих СД25+ маркер ранней активации,  было увеличенным в сравнении с физиологической беременностью при I,  II и III степенях гипоксии (р<0,05). В динамике гипоксии количество СД25+ лимфоцитов было увеличенным при II степени гипоксии в сравнении с I и III, и снижено при  III в сравнении с I (р<0,05). Количество лимфоцитов, несущих СД27+ рецептор в плаценте крыс с пренатальной гипоксией было увеличено при I, II и III степени гипоксии в сравнении с аналогичными данными контроля (р<0,05). В динамике гипоксии при II и III степени показатели СД27+ лимфоцитов практически не различались между собой, но были достоверно меньше в сравнении с I степенью гипоксии. Иммунорегуляторный индекс (ИРИ), оцениваемый по соотношению СД4+/СД8+ лимфоцитов, выявил увеличение индекса при всех степенях гипоксии в сравнении с контролем (р<0,05). По мере нарастания тяжести гипоксии при III степени отмечались самые высокие показатели ИРИ в сравнении с данными, выявленными при I и II степени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

  1. Гипоксия вызывает изменения в иммунной системе экспериментальных животных относительно данных, полученных при физиологической беременности, приводя к разбалансировке количественных показателей иммунитета на системном (периферическая кровь), локальном (плацента) уровнях. Это выражается в следующем:

– на системном уровне, в периферической крови имело место снижение при гипоксии II степени количества СД3+, СД16+;   при I, II степени снижение  СД4+, СД25+, ИРИ;  при III степени снижение  СД8+; снижение СД27+ лимфоцитов при I,II,III степени; пул лимфоцитов нарастал при III степени гипоксии среди СД3+, СД25+ и при I и II степени среди СД8+ лимфоцитов,

– на локальном уровне, в плаценте при гипоксии I, II степени регистрировалось увеличение количества СД3+, СД4+, СД8+; при I-III степени количество СД16+, СД25+, СД27+ лимфоцитов, ИРИ и снижение при III степени гипоксии количества СД3+, СД4+, СД8+ клеток.

2.   По мере нарастания степени гипоксии  субпопуляционный состав лимфоцитов менялся в зависимости от тяжести патологии (уменьшение СД3+, СД4+,СД16+ при II степени в сравнении с I; снижение СД8+, СД27+ при III  в сравнении с I и II,  нарастание СД3+, СД4+ при III степени) в периферической крови; на локальном уровне  в плаценте  – (уменьшение при III степени СД3+, СД4+, СД8+; снижение при II степени СД16+, СД27+; увеличение при II степени СД4+, СД8+,СД25+- лимфоцитов).

Литература:

1      Мамедалиева Н.М., и др. Клинико-морфологические и лабораторные параллели при различных формах плацентарной недостаточности у беременных с привычным невынашиванием //Азиатский вестник акушеров-гинекологов. – 1998. – №2. – с. 37-40.

2 Стрижакова А.М., Подзолкова Н.М., Иванина А.В. Роль иммунных нарушений в патогенезе гнойных воспалительных заболеваний придатков матки.// Акушерство и гинекология. – 1994. – №8. – с. 52-57.

3      Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Ерошкина Н.В., Кудряшова А.В., Астраух Н.В., Соловьева Т.А., Букина Е.А. Локальный иммунный ответ в динамике неосложненной беременности //Медицинская иммунология. – 2000. – Т. 2, №2. – с. 194-195.

4  Чистякова Г.Н., Черданцева Г.А. Экспрессия маркеров активации иммунной системы в ранние сроки беременности // Иммунология. – 2004. – №6. – с. 377-378.

5   Севастьянова О.Ю., Теплова С.И., Черданцева Г.А. и др.Показатели популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при неосложненной беременности по материалам проточной цитофлюориметрии // Журн. микробиол. – 2001. – №4. – с. 97-100.

6   Шмагель К.В., Черешнев В.А. Иммунитет беременной жен­щины. – М.: Медицинская книга, 2003. – 226 с.

1. Симонова А.В. Фенотип лимфоцитов крови при воспалительных заболеваниях человека. – 2001.- М. ИНТО.