+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

Определение нуклеотидных полиморфизмов с помощью систем генетического анализа, основанных на пиросеквенировании

Автор: К.О. Миронов, Е.А. Дунаева, О.П. Дрибноходова, Г.А. Шипулин
Место работы: ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора

Ис­сле­до­ва­ния по пол­но­ге­ном­но­му скри­нин­гу ас­со­ци­а­ций (Genome-WideAssociationStudy) в ря­де слу­ча­ев по­зво­ля­ют вы­явить од­но­нук­ле­о­тид­ные поли­мор­физ­мы (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) в ге­но­ме че­ло­ве­ка, свя­зан­ные или ас­со­ци­и­ро­ван­ные с раз­лич­ны­ми со­сто­я­ни­ями, и, в том чис­ле, с не­ко­то­ры­ми за­бо­ле­ва­ни­я­ми. На се­год­няш­ний день из­вес­т­но не­сколь­ко со­тен ге­не­ти­чес­ких ло­ку­сов, боль­шин­ст­во из ко­то­рых пред­став­ле­ны од­но­нук­ле­о­тид­ны­ми по­ли­мор­физ­ма­ми, для ко­то­рых по­ка­за­на ас­со­ци­а­ция с раз­ви­ти­ем час­тых со­ма­ти­чес­ких за­бо­ле­ва­ний и па­то­ло­ги­чес­ких син­д­ро­мов.

Дан­ные о свя­зи «по­ли­мор­физм-за­бо­ле­ва­ние» дос­туп­ны че­рез фун­к­ци­о­ни­ру­ю­щие био­ин­фор­ма­ци­он­ные Ин­тер­нет-ре­сур­сы. Удоб­ным био­ин­фор­ма­ци­он­ным ре­сур­сом, пред­на­зна­чен­ным, в том чис­ле, для сбо­ра, по­ис­ка и ана­ли­за ин­фор­ма­ции об опи­сан­ных ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­ма­х и их ас­со­ци­а­ци­ях с за­бо­ле­ва­ни­я­ми, яв­ля­ет­ся пор­тал На­ци­о­наль­но­го цен­т­ра био­тех­но­ло­ги­чес­кой ин­фор­ма­ции (National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health USA) – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Ресурс содержит базы данных о заболеваниях «OMIM» (OnlineMendelian или InheritanceinMan) и ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­мах («SNP»), и по­сто­ян­но об­нов­ля­е­мую ба­зу дан­ных на­уч­ных пуб­ли­ка­ций «PubMed». Каж­дый од­но­нук­ле­о­тид­ный по­ли­мор­физм име­ет свой иден­ти­фи­ка­ци­он­ный но­мер (rs-обо­зна­че­ние), ко­то­рый по­зво­ля­ет од­но­знач­ным об­ра­зом со­пос­тав­лять дан­ные о том или ином по­ли­мор­физ­ме, по­лу­чен­ные в не­за­ви­си­мых ис­сле­до­ва­ни­ях, а так­же про­во­дить по­иск ин­фор­ма­ции в пуб­ли­ка­ци­ях и дру­гих ба­зах дан­ных.

Боль­шин­ст­во со­ци­аль­но-зна­чи­мых бо­лез­ней, та­ких как ише­ми­чес­кая бо­лезнь сер­д­ца, он­ко­ло­ги­чес­кие за­бо­ле­ва­ния, са­хар­ный ди­а­бет 2 ти­па и дру­гих, воз­ни­ка­ют под вли­я­ни­ем­нас­лед­ст­вен­ны­х и сре­до­вых фак­то­ров. В ка­чес­т­ве на­след­ст­вен­ных фак­то­ров мож­но рас­смат­ри­вать по­ли­мор­физ­мы в ге­нах, про­дук­ты ко­то­рых ­вов­ле­че­ны в фи­зи­о­ло­ги­чес­кие про­цес­сы, или по­ли­мор­физ­мы, для ко­то­рых в по­пу­ля­ци­он­ных ис­сле­до­ва­ни­ях по­ка­за­на ас­со­ци­а­ция с тем или иным за­бо­ле­ва­ни­ем.

Дру­гим кли­ни­чес­ким при­ло­же­ни­ем де­тек­ции ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­мов яв­ля­ют­ся фар­ма­ко­ге­не­ти­чес­кие ис­сле­до­ва­ния – из­уче­ние ге­не­ти­чес­ких фак­то­ров, об­ус­лав­ли­ва­ю­щих ин­ди­ви­ду­аль­ные фар­ма­ко­ло­ги­чес­кие ре­ак­ции раз­лич­ных ле­кар­ст­вен­ных пре­па­ра­тов или их со­че­та­ний. Опи­са­ны кли­ни­чес­кие про­яв­ле­ния по­ли­мор­физ­мов в ге­нах, во­вле­чен­ных в про­цес­сы транс­пор­та и ме­та­бо­лиз­ма ле­кар­ст­вен­ных пре­па­ра­тов, а так­же в ге­нах, ко­ди­ру­ю­щих мо­ле­ку­лы-ми­ше­ни, вли­яю­щие на эф­фек­тив­ность и без­опас­ность при­ме­не­ния мно­гих ле­кар­ст­вен­ных средств. Вы­яв­ле­ние дан­ных по­ли­мор­физ­мов по­зво­ля­ет прог­но­зи­ро­вать от­вет ор­га­низ­ма на ле­кар­ст­вен­ное сред­ст­во, и, сле­до­ва­тель­но, ин­ди­ви­ду­аль­но под­хо­дить к вы­бо­ру те­ра­пии, что по­вы­ша­ет эф­фек­тив­ность и без­опас­ность фар­ма­ко­те­ра­пии. Для не­ко­то­рых пре­па­ра­тов раз­ра­бо­та­ны ал­го­рит­мы и ре­ко­мен­да­ции кли­ни­чес­ко­го при­ме­не­ния в за­ви­си­мос­ти от ге­не­ти­чес­ких осо­бен­нос­тей па­ци­ен­та. Раз­ра­бо­та­ны on-line ре­сур­сы для ин­тер­пре­та­ции ре­зуль­та­тов не­ко­то­рых фар­ма­ко­ге­не­ти­чес­ких ­тес­тов (на­при­мер, www.warfarindosing.org/ и http://nat2pred.rit.albany.edu/).

В свя­зи с этим, ге­не­ти­чес­кий ана­лиз од­но­нук­ле­о­тид­ных по­ли­мор­физ­мов, об­ус­лав­ли­ва­ю­щих риск воз­ник­но­ве­ния за­бо­ле­ва­ния или не­же­ла­тель­но­го фар­ма­ко­ло­ги­чес­ко­го от­ве­та, мо­жет быть ис­поль­зо­ван в кли­ни­чес­кой прак­ти­ке для вы­яв­ле­ния лиц, име­ю­щих ге­не­ти­чес­кую пред­рас­по­ло­жен­ность к то­му или ино­му за­бо­ле­ва­нию, а так­же для адек­ват­но­го на­зна­че­ния ле­кар­ст­вен­ной те­ра­пи­ис уче­том ин­ди­ви­ду­аль­ных фар­ма­ко­ге­не­ти­чес­ких осо­бен­нос­тей. Ран­нее вы­яв­ле­ние па­ци­ен­тов, наи­бо­лее под­вер­жен­ных рис­ку за­бо­ле­ва­ния, на ве­ро­ят­ность воз­ник­но­ве­ния ко­то­ро­го ока­зы­ва­ют вли­я­ние как ге­не­ти­чес­кие, так и сре­до­вые, т.е. мо­ди­фи­ци­ру­е­мые, фак­то­ры, по­зво­ля­ет в ря­де слу­ча­ев пла­ни­ро­вать про­ве­де­ние про­фи­лак­ти­чес­ких ме­ро­при­ятий на до­сим­п­то­ма­ти­чес­ком эта­пе.

Для вы­яв­ле­ния од­но­нук­ле­о­тид­ных по­ли­мор­физ­мов ге­но­ма­ ис­поль­зу­ет­ся ши­ро­кий спектр мо­ле­ку­ляр­но-био­ло­ги­чес­ких ме­то­дов, ос­но­ван­ных на ПЦР. К наи­бо­лее рас­прос­т­ра­нен­ным ме­то­дам мож­но от­нес­ти ана­лиз по­ли­мор­физ­ма длин рес­т­рик­ци­он­ных фраг­мен­тов, ал­лель-спе­ци­фи­чес­кую ПЦР, раз­лич­ные ва­ри­ан­ты ПЦР в ре­жи­ме ре­аль­но­го вре­ме­ни, гиб­ри­ди­за­цию с ис­поль­зо­ва­ни­ем ДНК-чи­пов, масс-спек­т­ро­мет­ри­чес­кий ана­лиз и ме­то­ды сек­ве­ни­ро­ва­ния ДНК. Раз­лич­ные ва­ри­ан­ты пе­ре­чис­лен­ных ме­то­дов ис­поль­зу­ют­ся в на­уч­ных и кли­ни­чес­ких ла­бо­ра­то­ри­ях, на рын­ке пред­став­ле­ны на­бо­ры ре­а­ген­тов для де­тек­ции не­ко­то­рых кли­ни­чес­ки зна­чи­мых по­ли­мор­физ­мов. В то же вре­мя из всех пе­ре­чис­лен­ных ме­то­дов­ толь­ко сек­ве­ни­ро­ва­ни­е яв­ля­ет­ся пря­мым ме­то­дом опре­де­ле­ния нук­ле­о­тид­ной по­сле­до­ва­тель­нос­ти, что по­зво­ля­ет од­но­знач­но ин­тер­пре­ти­ро­вать по­лу­чен­ный ре­зуль­тат – нук­ле­о­тид­ную по­сле­до­ва­тель­ность в об­лас­ти по­ли­мор­физ­ма и нук­ле­о­тид­ный по­ли­мор­физм в го­мо- или ге­те­ро­зи­гот­ном со­сто­я­нии.

Су­щес­т­ву­ет мно­жес­т­во под­хо­дов для опре­де­ле­ния нук­ле­о­тид­ной по­сле­до­ва­тель­нос­ти, из ко­то­рых в на­сто­я­щее вре­мя наи­бо­лее рас­прос­т­ра­нен­ны­ми в прак­ти­ке кли­ни­чес­ких и на­уч­ных ла­бо­ра­то­рий яв­ля­ют­ся: сек­ве­ни­ро­ва­ние с ис­поль­зо­ва­ни­ем флу­о­рес­цен­т­но­ме­че­ных­ ди­де­зок­си­нук­ле­о­ти­дов с по­сле­ду­ю­щим ана­ли­зом ме­то­дом ка­пил­ляр­но­го элек­т­ро­фо­ре­за (сек­ве­ни­ро­ва­ни­е­ ме­то­дом Сэн­ге­ра), пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ние, груп­па ме­то­дов сек­ве­ни­ро­ва­ния «но­во­го по­ко­ле­ния» (next generation sequencing). Основ­ные от­ли­чия ме­то­дов про­яв­ля­ют­ся в дли­не опре­де­ля­е­мых по­сле­до­ва­тель­нос­тей и в про­пус­к­ной спо­соб­нос­ти обо­ру­до­ва­ния, ис­поль­зу­е­мо­го для ге­не­ти­чес­ко­го ана­ли­за. Удоб­ны­ми и вы­со­ко­про­из­во­ди­тель­ны­ми п­лат­фор­ма­ми, спе­ци­аль­но раз­ра­бо­тан­ны­ми для опре­де­ле­ни­я од­но­нук­ле­о­тид­ных по­ли­мор­физ­мов с по­мо­щью пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ния, яв­ля­ют­ся сис­те­мы ге­не­ти­чес­ко­го ана­ли­за се­рии «PyroMark» («Qiagen»).

Пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ние

Прин­цип ме­то­да­ пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ния, так­же обо­зна­ча­е­мо­го как пи­ро­сек­ве­ни­ру­ю­щий син­тез или сек­ве­ни­ро­ва­ние пу­тем син­те­за, был раз­ра­бо­тан в 1996 г. По­лом Ни­ро­ном (Pal Nyren) в Ко­ро­лев­ском тех­ни­чес­ком ин­сти­ту­те (Сток­гольм, Шве­ция).

В ос­но­ве ме­то­да – де­тек­ци­я­ пи­ро­фос­фа­та, ко­то­рый вы­сво­бож­да­ет­ся п­ри син­те­зе двух­це­по­чеч­ной ДНК на мат­ри­це од­но­це­по­чеч­ной ДНК. В ка­чес­т­ве за­трав­ки для син­те­за ДНК в ре­ак­ции учас­т­ву­ет прай­мер для сек­ве­ни­ро­ва­ния, ком­п­ле­мен­тар­ный об­лас­ти, в ко­то­рой на­хо­дит­ся де­тек­ти­ру­е­мый по­ли­мор­физм. По­сле об­ра­зо­ва­ния дуп­лек­са «ДНК – прай­мер для сек­ве­ни­ро­ва­ния» в ре­ак­ци­он­ную смесь до­бав­ля­ют­ся нук­ле­о­ти­ды в по­сле­до­ва­тель­нос­ти, со­от­вет­ст­ву­ю­щей ­пос­ле­до­ва­тель­нос­ти сек­ве­ни­ру­е­мо­го ­ге­не­ти­чес­ко­го ло­ку­са. В слу­чае, ес­ли ­нук­ле­о­тид ком­п­ле­мен­та­рен по­сле­до­ва­тель­нос­ти, при его встра­и­ва­ни­и­ во вновь син­те­зи­ру­е­мую цепь ДНК про­ис­хо­дит вы­сво­бож­де­ние пи­ро­фос­фа­та. В ре­зуль­та­те фер­мен­та­тив­ных ре­ак­ций с учас­ти­ем пи­ро­фос­фа­та ре­гис­т­ри­ру­ет­ся хе­ми­лю­ми­нес­цен­т­ный сиг­нал. Нев­стро­ен­ные нук­ле­о­ти­ды раз­ру­ша­ют­ся при­сут­ст­ву­ю­щей в ре­ак­ци­он­ной сме­си апи­ра­зой. По­сле­до­ва­тель­но­му до­бав­ле­нию нук­ле­о­ти­дов бу­дет со­от­вет­ст­во­вать гра­фик (пи­ро­грам­ма), на ко­то­ром по го­ри­зон­таль­ной оси бу­дут от­ме­чать­ся нук­ле­о­ти­ды, до­бав­ля­е­мые в ре­ак­ци­он­ную смесь, а по вер­ти­каль­ной оси – уро­вень хе­ми­лю­ми­нес­цен­т­но­го сиг­на­ла, при­чем уро­вень сиг­на­ла про­пор­ци­о­на­лен ко­ли­чес­т­ву встро­ен­ных в цепь ДНК нук­ле­о­ти­дов. В за­ви­си­мос­ти от на­прав­ле­ния сек­ве­ни­ро­ва­ния – ори­ен­та­ции прай­ме­ра для сек­ве­ни­ро­ва­ния – раз­ли­ча­ют пря­мой (foward) иоб­рат­ный (reverse) ти­пы ана­ли­за.

При­мер пи­ро­грам­мы пред­став­лен на ри­сун­ке 1. Для сек­ве­ни­ро­ва­ния об­лас­ти по­ли­мор­физ­ма 2677G>T/A ге­наABCB1 (rs2032582) за­да­ет­ся по­сле­до­ва­тель­ность GA/C/TACCTTCT (по­ли­мор­ф­ные нук­ле­о­ти­ды раз­де­ле­ны зна­ком «/»), для ко­то­рой про­грам­мное обес­пе­че­ние при­бо­ра за­да­ет сле­ду­ю­щий по­ря­док до­бав­ле­ния нук­ле­о­ти­дов в ре­ак­ци­он­ную смесь: CGCTACTCT. На гра­фи­ке об­ласть по­ли­мор­физ­ма вы­де­ле­на цве­том. Пер­вый нук­ле­о­тид (С) от­сут­ст­ву­ет в нук­ле­о­тид­ной по­сле­до­ва­тель­нос­ти, ко­то­рая сек­ве­ни­ру­ет­ся, по­это­му он не встра­и­ва­ет­ся в син­те­зи­ру­е­мую цепь ДНК и­ пи­ро­фос­фат не де­тек­ти­ру­ет­ся: уро­вень сиг­на­ла ра­вен ну­лю. Ре­фе­рен­с­ные нук­ле­о­ти­ды, при­сут­ст­ву­ю­щие в об­лас­ти по­ли­мор­физ­ма – №2 (G), №6 (С), №7 (Т), №8 (С) и №9 (Т) встра­и­ва­ют­ся в син­те­зи­ру­е­мую цепь ДНК и де­тек­ти­ру­ют­ся про­пор­ци­о­наль­но их ко­ли­чес­т­ву: G, СС, ТТ, С и Т, со­от­вет­ст­вен­но. Ана­лиз об­лас­ти по­ли­мор­физ­ма осу­щес­т­в­ля­ет­ся ав­то­ма­ти­чес­ки про­грам­мным обес­пе­че­ни­ем на ос­но­ва­нии от­но­си­тель­ных вы­сот сиг­на­лов в по­ли­мор­ф­ной об­лас­ти (по от­но­ше­нию к сиг­на­лам, со­от­вет­ст­ву­ю­щих ре­фе­рен­с­ным нук­ле­о­ти­дам). На вер­х­нем ри­сун­ке де­тек­ти­ру­ет­ся ге­но­тип СС (от­но­си­тель­ная вы­со­та встра­и­ва­емых в цепь ДНК нук­ле­о­ти­дов A – 0%, С – 99% и T – 1%), на ниж­нем – ге­те­ро­зи­го­та АС (A – 52%, С – 47% и T – 2%). По­сколь­ку прай­мер, с ко­то­ро­го про­во­дит­ся сек­ве­ни­ро­ва­ние (син­тез вто­рой це­пи ДНК), ори­ен­ти­ро­ван в об­рат­ном на­прав­ле­нии, в со­от­вет­ст­вии с но­мен­к­ла­ту­рой обо­зна­че­ния по­ли­мор­физ­ма, вы­яв­лен­ные ге­но­ти­пы сле­ду­ет обо­зна­чить как GG и GT.

Эта­пы пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ния

Опре­де­ле­ние нук­ле­о­тид­ной по­сле­до­ва­тель­нос­ти с по­мо­щью сис­тем ге­не­ти­чес­ко­го ана­ли­за «PyroMark» со­сто­ит из эта­пов вы­де­ле­ния ДНК, ам­п­ли­фи­ка­ции и по­ста­нов­ки ре­ак­ции пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ния.

Пер­вым эта­пом ана­ли­за яв­ля­ет­ся на­ра­бот­ка ам­п­ли­ко­на, со­дер­жа­ще­го по­ли­мор­ф­ный ге­не­ти­чес­кий ло­кус. Этап вклю­ча­ет в се­бя вы­де­ле­ние ге­ном­ной ДНК и по­ста­нов­ку ПЦР.

При про­ве­де­нии ПЦР один из па­ры прай­ме­ров, ори­ен­ти­ро­ван­ный в об­рат­ном на­прав­ле­нии от­но­си­тель­но на­прав­ле­ния сек­ве­ни­ро­ва­ния за­дан­но­го фраг­мен­та ДНК, дол­жен быть­ с­вя­зан на 5’-кон­це с би­о­ти­ном. Цепь ДНК, вклю­ча­ю­щая по­сле­до­ва­тель­ность би­о­ти­ни­ли­ро­ван­но­го п­рай­ме­ра, яв­ля­ет­ся мат­ри­цей для пи­ро­сек­ве­ни­ру­ю­ще­го син­те­за. После ам­п­ли­фи­ка­ции про­во­дит­ся очис­т­ка и де­на­ту­ра­ция двух­це­по­чеч­но­го­ ам­п­ли­ко­на. Для это­го ПЦР-фраг­мент ин­ку­би­ру­ет­ся с час­ти­ца­ми се­фа­ро­зы, по­кры­ты­ми стреп­та­ви­ди­ном, и, при по­мо­щи стан­ции для про­бо­под­го­тов­ки (Vacuum Prep Workstation, «Qiagen»), про­во­дит­ся де­на­ту­ра­ция двух­це­по­чеч­ной ДНК и се­рия от­мы­вок, в ре­зуль­та­те ко­то­рых об­ра­зу­ет­ся од­но­це­по­чеч­ный ПЦР-про­дукт. Одно­це­по­чеч­ный ПЦР-про­дук­т им­мо­би­ли­зи­ру­ет­ся на по­вер­х­ность план­ше­та для сек­ве­ни­ро­ва­ния, в лун­ки ко­то­ро­го­ до­бав­лен­ бу­фер, со­дер­жа­щий прай­мер, с ко­то­ро­го про­во­дит­ся сек­ве­ни­ро­ва­ние. В ре­зуль­та­те от­жи­га сек­ве­ни­ру­ю­ще­го прай­ме­ра­ на им­мо­би­ли­зи­ро­ван­ну­ю од­но­це­по­чеч­ную цепь ДНК об­ра­зу­ет­ся ДНК/ДНК-дуп­лекс, не­об­хо­ди­мый для син­те­за вто­рой це­пи ДНК. Этап про­бо­под­го­тов­ки 24-х об­раз­цов за­ни­ма­ет при­мер­но 30 ми­нут, что су­щес­т­вен­но мень­ше вре­ме­ни, не­об­хо­ди­мо­го для под­го­тов­ки об­раз­цов для сек­ве­ни­ро­ва­ния дру­ги­ми ме­то­да­ми.

За­клю­чи­тель­ным эта­пом ана­ли­за яв­ля­ет­ся сек­ве­ни­ро­ва­ние ПЦР-про­дук­та – про­ве­де­ние ре­ак­ции пи­ро­сек­ве­ни­ру­ю­ще­го син­те­за и ана­лиз по­лу­чен­ных ре­зуль­та­тов. Ре­ак­ция про­во­дит­ся в ав­то­ма­ти­чес­ком ре­жи­ме с ис­поль­зо­ва­ни­ем сис­тем ге­не­ти­чес­ко­го ана­ли­за (пи­ро­сек­ве­на­то­ров) се­рии «PyroMark» («Qiagen»).

На­бор ре­а­ген­тов «АмплиСенс® Пи­рос­к­рин»

На ба­зе тех­но­ло­гии пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ния бы­ли раз­ра­бо­та­ны ме­то­ди­ки для де­тек­ции бо­лее 130 ге­не­ти­чес­ких ло­ку­сов. Кри­те­рии вы­бо­ра ге­не­ти­чес­ких ло­ку­сов для ге­не­ти­чес­ко­го ана­ли­за бы­ли сле­ду­ю­щие: ис­сле­ду­е­мые ге­не­ти­чес­ки­е ­по­ли­мор­физ­мы бы­ли­ о­пи­са­ны в ра­бо­тах по пол­но­ге­ном­но­му скри­нин­гу ас­со­ци­а­ций, свя­зан­ных с раз­ви­ти­ем час­тых муль­ти­фак­то­ри­аль­ных за­бо­ле­ва­ний, или дру­гих ра­бо­тах, по­зво­ля­ю­щих вы­явить связь или ас­со­ци­а­цию по­ли­мор­физ­ма с пред­рас­по­ло­жен­нос­тью к раз­лич­ным со­сто­я­ни­ям и не­же­ла­тель­ным фар­ма­ко­ло­ги­чес­ким ре­ак­ци­ям. Так­же при вы­бо­ре ге­не­ти­чес­ких ло­ку­сов при­ни­мал­ся во вни­ма­ние спектр ис­сле­до­ва­ний нук­ле­о­тид­ных по­ли­мор­физ­мов, уже при­сут­ст­во­вав­ших на оте­чес­т­вен­ном био­тех­но­ло­ги­чес­ком рын­ке. При раз­ра­бот­ке ме­то­ди­к у­чи­ты­ва­лись тре­бо­ва­ния про­из­во­ди­те­ля обо­ру­до­ва­ния для пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ния, предъ­яв­ля­е­мые к ис­поль­зу­е­мым для ам­п­ли­фи­ка­ции и сек­ве­ни­ро­ва­ни­я о­ли­го­нук­ле­о­ти­дам и ре­а­ген­там.

Часть раз­ра­бо­тан­ных ме­то­дик бы­ла адап­ти­ро­ва­на к наи­бо­лее рас­прос­т­ра­нен­ным мо­де­лям ам­п­ли­фи­ка­то­ро­в и вклю­че­на в на­бор ре­а­ген­тов «АмплиСенс® Пи­рос­к­рин». На­бор ре­а­ген­тов вклю­ча­ет в се­бя 28 форм ком­п­лек­та­ции, для 24 форм ком­п­лек­та­ции (112 ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­мов) по­лу­че­но ре­гис­т­ра­ци­он­ное удос­то­ве­ре­ние (№ ФСР 2012/13246 от 19 мар­та 2012 г.). Фор­мам ком­п­лек­та­ции №2-28 со­от­вет­ст­ву­ют про­фи­ли ис­сле­до­ва­ний­ ге­не­ти­чес­кой пред­рас­по­ло­жен­нос­ти к час­тым муль­ти­фак­то­ри­аль­ным за­бо­ле­ва­ни­ям, а так­же фар­ма­ко­ге­не­ти­чес­кие и не­ко­то­рые дру­гие тес­ты. Спи­сок форм ком­п­лек­та­ции №2-28 и вклю­чен­ных в них по­ли­мор­физ­мов пред­став­лен в таб­ли­це. Фор­ма ком­п­лек­та­ции №1 пред­став­ля­ет со­бой на­бор «Пи­роп­реп», не­об­хо­ди­мый для про­ве­де­ния про­бо­под­го­тов­ки и по­лу­че­ния од­но­це­по­чеч­ной ДНК при де­тек­ции ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­мов, вклю­чен­ных в фор­мы ком­п­лек­та­ции №2-24.

При про­ве­де­нии ис­сле­до­ва­ния для вы­де­ле­ния ге­ном­ной ДНК мо­гут быть ис­поль­зо­ва­ны на­бо­ры ре­а­ген­тов «РИБО-преп», «ДНК-сорб-B» и дру­гие на­бо­ры про­из­вод­ст­ва ФБУН «Цен­т­раль­но­го НИИ эпи­де­ми­о­ло­гии» Рос­пот­реб­над­зо­ра. Про­грам­мы про­ве­де­ния ПЦР и ин­струк­ция по про­бо­под­го­тов­ке­ ам­п­ли­ко­нов с ис­поль­зо­ва­ни­ем стан­ции Vacuum Prep Workstation уни­вер­саль­ны для всех тес­тов, что да­ет воз­мож­ность для од­но­вре­мен­но­го ана­ли­за не­сколь­ких ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­мов. Нук­ле­о­тид­ные по­сле­до­ва­тель­нос­ти ана­ли­зи­ру­е­мых ге­не­ти­чес­ких ло­ку­сов со­дер­жат­ся в со­от­вет­ст­ву­ю­щих ин­струк­ци­ях к при­ло­же­ни­ям. До­пол­ни­тель­ная ин­фор­ма­ция обо всех ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­мах, вклю­чен­ных в про­фи­ли ге­не­ти­чес­ких ис­сле­до­ва­ний, дос­туп­на че­рез ба­зу дан­ных од­но­нук­ле­о­тид­ных по­ли­мор­физ­мов На­ци­о­наль­но­го цен­т­ра био­тех­но­ло­ги­чес­кой ин­фор­ма­ции.

С по­мо­щью сис­те­мы ге­не­ти­чес­ко­го ана­ли­за «PyroMarkQ24» («Qiagen») раз­ра­бо­та­на ме­то­ди­ка­ де­тек­ции ак­ти­ви­ру­ю­щих со­ма­ти­чес­ких му­та­ций в ге­нах KRAS и BRAF, вы­яв­ле­ние ко­то­рых вли­яет на на­зна­че­ни­е ­тар­гет­ных пре­па­ра­тов к ре­цеп­то­ру эпи­дер­маль­но­го фак­то­ра рос­та при не­ко­то­рых он­ко­ло­ги­чес­ких за­бо­ле­ва­ни­ях. Акти­ви­ру­ю­щие со­ма­ти­чес­кие му­та­ции в ге­не KRAS на­хо­дят­ся в об­лас­ти 12–16 ко­до­нов, BRAF – 593–601 ко­до­нов. Для ана­ли­за этих ге­не­ти­чес­ких ло­ку­сов не­об­хо­ди­мо по­лу­чить нук­ле­о­тид­ную по­сле­до­ва­тель­ность дли­ной в не­сколь­ко де­сят­ков пар ос­но­ва­ний, что да­ет воз­мож­ность ­д­ля опре­де­ле­ния лю­бой ­ак­ти­ви­ру­ю­щей му­та­ции, по­явив­шей­ся в сек­ве­ни­ру­е­мой об­лас­ти. Пре­дел де­тек­ции ме­то­ди­ки для са­мых час­тых му­та­ций со­став­ля­ет 3–5% му­тан­т­ной фрак­ции ДНК в ана­ли­зи­ру­е­мом об­раз­це. При­мер сек­ве­ни­ро­ва­ния нук­ле­о­тид­ной по­сле­до­ва­тель­нос­ти, со­от­вет­ст­ву­ю­щей 593–601 ко­до­нам ге­на BRAF, c вы­яв­лен­ной му­та­ци­ей V600E (1799T>A) пред­став­лен на ри­сун­ке 2.

По­сколь­ку при­бо­ры для пи­ро­се­к­ве­ни­ро­ва­ния яв­ля­ют­ся от­кры­ты­ми си­с­те­ма­ми ге­не­ти­че­с­ко­го ана­ли­за и есть раз­ра­бо­тан­ный при со­зда­нии на­бо­ра ре­а­ген­тов «АмплиСенс® Пиро­скрин» уни­вер­саль­ный про­то­кол ис­сле­до­ва­ния ге­не­ти­че­с­ких ло­ку­сов, существует возможность расширения спектра ана­ли­зи­ру­е­мых ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­мов и про­фи­лей ге­не­ти­чес­ких ис­сле­до­ва­ний в со­от­вет­ст­вии с пуб­ли­ку­е­мы­ми дан­ны­ми о свя­зях ге­не­ти­чес­ких по­ли­мор­физ­мов с те­ми или ины­ми кли­ни­чес­ки­ми со­сто­я­ни­ями.

Лаб мед