+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

Мультиплексный анализ: история и перспективы

Автор: Л.Л. Ахмалтдинова
Место работы: Карагандинский государственный медицинский университет Караганда

Резюме

В кратком обзоре представлены данные об истории развития мультиплексного иммуноанализа, разновидностях мультиплексных тестов, используемых в клинической практике: лайт-блот, проточная цитометрия, система Дельфия, Ультраплекс, биочипы и иммуносенсоры. Приведены их преимущества и ограничения. Приведен пример использования технологии xMap в практике научно-исследовательской лаборатории.

Лабораторная диагностика – активно развивающаяся область на стыке медицины и технологии. Разработка новых диагностических маркеров с одной стороны, появление новых инженерных решений для их фиксации с другой, ведут к бурному прогрессу в области развития медицинских лабораторных  технологий. Автоматизация и стандартизация, упрощение и ускорение проведения анализа являются основными направлениями эволюции медицинской лабораторной технологии. Одной из возможностей упрощения и ускорения анализа становится развитие мультиплексных технологий. Основными достоинствами мультиплексных анализаторов становятся:

1. Снижение трудозатрат;

2. Увеличение скорости выполнения анализа;

3. Высокая  воспроизводимость в анализе взаимосвязанных аналитов (1оператор, 1 метод, 1 прибор, одновременный анализ);

4. Экономия реактивов;

5. Экономия биоматериала.

Технологии, в том или ином виде использовавшие принципы мультиплексного анализа, используются давно. Истинная мультиплексность стала возможна с развитием имунноанализа, так как высокая специфичность соединения антигена и антитела, подобная подбору ключа  к замку,  дает широкие возможности для детектирования  меченых лигандов в независимом анализе множества аналитов. Относительно простая технология получения моноклональных антител к широкому кругу белковых и пептидных молекул позволяет не ограничиваться выбором ключевых антигенов [1-3]. Проведем краткий обзор возможностей мультианализа.

Иммуноблот (Вестерн-блот). Метод является совмещением электрофореза и твердофазного иммуноферментного анализа. За счет разделения антигенов по заряду/массе по длине блота возможно одновременное обнаружение нескольких видов антител к инфекционным или аутоиммунным антигенам, каждый из которых будет точно охарактеризован. При лайт-блотинге на нитроцеллюлозную мембрану наносят рекомбинатные антигены. В итоге можно получить отпечаток 10-20 различных белков. Метод позволяет сократить расход реагентов и себестоимость анализа, по сравнению с ИФА, при качественном или полуколичественном методе детекции. Метод лайт-блотинга позволяет совместить техническую простоту ИФА и мультиплесксность. Однако свое широкое применение  иммуноблот получил за счет своей высокой специфичности и чувствительности. Мультиплексность является лишь побочным плюсом при диагностике инфекционных заболеваний, аллергических или аутоиммунных антител [4].

Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением (система Delfia). Это один из первых мультиплексных решений в современном понимании. Метод был разработан в конце 70-х годов в США. Эта разновидность иммуноферментного анализа  основана на принципах сорбции одного из реагентов на твердой фазе и применении технологии «сэндвича», т.е. двойного распознавания. Однако важным отличием метода является применение в качестве метки хелатов лантаноидов (редкоземельных элементов европия, самария, тербия и диспрозия). Спектр флуоресцентного излучения каждого из хелатов редкоземельных металлов, применяемых в данном анализе, отличается индивидуальностью, что позволяет проводить измерение независимо. Преимущества Delfiа – это высокая чувствительность, простота постановки, подобная ИФА, и возможный в теории анализ до 3-4  аналитов одновременно. Описываемая система обладает чувствительностью более 10-17 М [5]..

Проточная цитометрия. Развитие иммунологии и клеточных технологий поставило задачу подробного изучения фенотипа каждой клетки, что невозможно без мультиплексного анализа ее маркеров. Принцип проточной цитометрии состоит в оптическом анализе меченых клеток или их частей в гидродинамически узконаправленном потоке, который  пересекает сфокусированный лазерный пучок. Оптические сигналы фиксируются системой фотоумножителей и зеркал. Современные цитометры позволяют определять более десятка флуоресцентных маркеров на одной клетке или до десяти растворимых аналитов (чаще клеточного происхождения) на наносферах в проточном цитометре за счет использования комбинации частиц разного размера, подобранных флуохромов, настроек нескольких лазеров [6].

Качественным прорывом в мультиплексном анализе стала технология Ultraplex, которая базируется на алюминевом носителе, толщиной тоньше человеческого волоса, на котором можно наносить антигены или антитела, комплиментрарные к искомому лиганду, меченые флуоресцентными красителями. Каждый из видов носителей идентифицируют штрих-кодом. Аналоговое кодирование носителя, независимость от дополнительных флуоресцентных ярлыков носителей, совместимость с любым из видов лиганд делает эту платформу уникальной мультиплексной технологией. Создатели утверждают: возможности мультиплексности их платформы неисчерпаемы. Система не используется на территории СНГ.

Технология биочипов (microarray) является одним из новых и перспективных направлений развития мультиплексного анализа. Она сочетает в себе миниатюрность, высокую специцифичность и мультиплексность. Первоначально система была разработана для микроанализа последовательности олигонуклеотидов, но сейчас получили распространение и протеиновые разновидности, которые основаны на принципах иммуноферментного анализа. Анализ проходит на поверхности биочипа с керамической, гелевой или мембранной подложкой, где в реакционном поле менее 1 квадратного сантиметра могут быть фиксированны сотни антигенов. Объем требуемой реакционной смеси измеряется  в нанолитрах, расход антигена измеряется  в пикограммах. Детекция основана на считывании флуоресцентного свечения в заданных микрозонах лазерным ридером.

Иммуносенсоры – новейшее направление, которое активно развивается. Иммуносенсоры – это устройства, состоящие из специфического антигена/антитела, которые используются в качестве датчика, связанного с преобразователем сигнала о связывании соответствующего лиганда. Выделяют разные типы передатчиков: измерители электрохимических  процессов (потенциометрия, амперометрия); измерители массы (пьезоэффект); измерители тепла (колориметрия); измерители оптического сигнала.  Непрямые иммуносенсоры основаны на использовании меченых компонентов для обнаружения связывания (флуоресценция, хемолюминесценция). Прямые иммуносенсоры обнаруживают связывание по переносу электронов, выделению или поглощению газов, разности потенциалов, сопротивления, массы, температуры или изменению оптических свойств и т.д. Потенциально данный подход позволяет определять широкий спектр веществ в концентрации от 10-9-10-13 М/л и выше. Основные преимущества иммуносенсороров:

  • миниатюрность и мобильность приборов;
  • возможность многократного использования чипа/сенсора;
  • в идеале – отсутствие реактивов как таковых;
  • высокая чувствительность и специфичность;
  • моментальная скорость анализа.

В настоящее время иммуносенсоры считаются перспективным направлением иммуноанализа, однако на практике существует весьма ограниченное количество коммерческих тест-систем, тест-системы мультиплексного назначения в активной разработке [7-9].

Технология хMap – «жидкие биочипы» – является еще одной из перспективных, активно развивающейся и доступной технологией мультиплексного анализа. Плюсом является появление этой технологии на рынке Казахстана – в виде приборов Bioplex 3Д. В лаборатории коллективного пользования НИЦ КГМУ используется данная технология, в связи с чем остановимся на ней подробнее. В основе хMap лежит несколько принципиальных разработок.  Одна из них – полистироловые микрочастицы (микросферы) с ферромагнитными свойствами, меченые двумя флюоресцентными красителями с разной длиной волны излучения.

Различные пропорции красителей позволяют составить до 500 спектральных адресов микрочастиц,  что значит до 500 аналитов в одной пробе. На данный момент максимальная мультиплексность составляет 22-27 аналитов, но производители обещают в самом ближайшем времени увеличить этот показатель.  Каждому адресу соотвествует один аналит, который может быть пришит на поверхности микросферы. В качестве лиганда может использоваться антитело или олигонуклеотид. Детекция концентрации проводится по интенсивности флуоресценции фикоэритрина каждой из микросфер. Проточная цитометрия, принцип которой лежит в основе анализа, с усовершенствованной системой фотоумножителей и компенсации, позволяет измерять интенсивность флуоресценции индивидуально у каждой из сфер. Красный лазер считывает свечения внутри микросферы и узнает ее вид, зеленый лазер считывает флуоресценцию с поверхности и вычисляет концентрацию прореагировавшего аналита. Третьей принципиальной разработкой является процессор, позволяющий дифференцировать поток сигналов от тысяч микросфер. Применение ферромагнитных частиц позволило значительно улучшить воспроизводимость, за счет стандартизации стадии промывки в магнитном поле. Плюсом технологии является привычный 96-луночный формат, процесс анализа, аналогичный стандартному иммуноферментному анализу и полная автоматизация считывания и обработки результатов при открытости системы [10]. В настоящее время выпускаются исследовательские и клинические системы, основанные на технологии xMap.

Собственный опыт применения Биоплекс в анализе 27 цитокинов сыворотки крови человека показал хорошую воспроизводимость, высокую скорость, низкие трудозатраты анализа по сравнению с твердофазным иммуноферментным анализом. Автоматический анализ массива данных, графического представленния, анализа калибровочных кривых  и пересчета облегчает процесс анализа массива данных. Методически анализ мало чем отличается от твердофазного ИФА. Была отмечена более высокая чувствительность метода (0,2-0,5 пг/мл) и большой динамический диапазон (от 0,2 пг/мл до 1500 пг/мл) по сравнению с хромогенным ИФА.

Кроме анализа белковых антигенов есть возможность определять  олигонуклеотиды и SNP. Разработаны тест-системы, которые позволяют на существующем оборудовании проводить HLA-типирование, диагностику генетических заболеваний, типирование вирусов и бактерий.

Резюмируя краткий обзор, можно отметить, что мультиплексные технологии неизбежно входят в практику лаборатории. Современные требования к диагностике все больше учитывают необходимость определения профиля множества аналитов:  эндокринного, метаболического, цитокинового, онкологического, изотипического, генетического. Диагностика аллергии и аутоиммунных заболеваний уже сейчас остро нуждается в высокопроизводительном анализе десятков аналитов. Использование флуоресцентных и хемилюминисцентных меток значительно повышают чувствительность детекции, по сравнению с хромогенным иммуноанализом. Универсальность, высокая воспроизводительность, экономичность мультиплексных систем обуславливают их привлекательность для внедерения в клиническую и исследовательскую практику.

Литература:

1. Ekins R. Immunoassays recent developments and future directions//Nucl. Med. Biol. 1994, №3. p. 495-521.

2. Ekins R.P. Multi-analyte immunoassay.//J. Pharm Biomed Anal. 1989, №2, р. 155-68.

3. Лапин С.В., Тотолян А.А. Иммунологическая диагностика аутоиммунных заболеваний. Издательство «Человек», С-Пб, 2010.

4. Hill H.R., Martins T.B. The flow cytometric analysis of cytokines using multi-analyte fluorescence microarray technology// Methods. 2006, №4, р. 12-6.

5. van Eeden P.E., Wiese M.D., Aulfrey S., Hales B.J. Using time-resolved fluorescence to measure serum venom-specific IgE and IgG.//PLoS One. 2011, №1, р. 16-41.

6. Zhang Y., Liu W., Ge S., Yan M., Wang S., Yu J., Li N., Song X. Multiplexed sandwich immunoassays using flow-injection electrochemiluminescence with designed substrate spatial-resolved technique for detection of tumor markers.// Biosens Bioelectron. 2013, №3, р. 684-90.

7. Petrou P.S., Kitsara M., Makarona E., Raptis I. Monolithically integrated biosensors based on Frequency-Resolved Mach-Zehnder Interferometers for multi-analyte determinations// Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 2010, р. 298-301.

8. Narang U., Gauger P.R., Kusterbeck A.W., Ligler F.S. Multianalyte detection using a capillary-based flow immunosensor.// Anal. Biochem. 1998, №1, р. 255.

9. Данилов А.Н. Технология xMAP в клинической лабораторной диагностике: возможности и перспективы//Лечебное дело2011, №4, с. 91-95.

Литература:

1. Ekins R. Immunoassays recent developments and future directions//Nucl. Med. Biol. 1994, №3. p. 495-521.

2. Ekins R.P. Multi-analyte immunoassay.//J. Pharm Biomed Anal. 1989, №2, р. 155-68.

3. Lapin S.V Totoljan A.A. Immunologichеskaja diagnostika autoimmunnyh zabolevanij. Izdatel’stvo «Chelovek», S-Pb, 2010. (in Russ.)

4. Hill H.R., Martins T.B. The flow cytometric analysis of cytokines using multi-analyte fluorescence microarray technology// Methods. 2006, №4, р. 12-6.

5. van Eeden P.E., Wiese M.D., Aulfrey S., Hales B.J. Using time-resolved fluorescence to measure serum venom-specific IgE and IgG.//PLoS One. 2011, №1, р. 16-41.

6. Zhang Y., Liu W., Ge S., Yan M., Wang S., Yu J., Li N., Song X. Multiplexed sandwich immunoassays using flow-injection electrochemiluminescence with designed substrate spatial-resolved technique for detection of tumor markers.// Biosens Bioelectron. 2013, №3, р. 684-90.

7. Petrou P.S., Kitsara M., Makarona E., Raptis I. Monolithically integrated biosensors based on Frequency-Resolved Mach-Zehnder Interferometers for multi-analyte determinations// Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 2010, р. 298-301.

8. Narang U., Gauger P.R., Kusterbeck A.W., Ligler F.S. Multianalyte detection using a capillary-based flow immunosensor.// Anal. Biochem. 1998, №1, р. 255.

9. Danilov A.N. Lechebnoe delo, 2011, №4, р. 91-95 (in Russ.)

Summary

Akhmaltdinova L.L.

MULTIANALYTE IMMUNOASSAY: HISTORY AND PROSPECTS

Karaganda state medical university. Karaganda

In the short review are submitted data on history development of the multiplex immunoassay, versions of the multiplex tests used in clinical practice: light-blot, flow cytometry, Delfy’s system, Ultraplex, immunosensors. Their advantages and restriction are given. The example of use of the xMap technology in practice of research laboratory is given.

Тұжырым

Ахмалтдинова Л.Л.

МУЛЬТИПЛЕКСТАЛДАУЛАР: ТАРИХИ ЖӘНЕ БОЛАШАҒЫ.

Караганды мемлекеттіқ медициналық университетті, Караганды

Қысқаша шолуда мультиплекслық иммунологиялық талдауын дамудың тарих туралы әңгiмеледi. Клиникалық тәжiрибе пайдаланылатын мультиплекс тестерiнiң бiр түрлерiнiң қиыры: лайт – блот, Дельфия, Ультраплекс, биочиптар және иммуносенсортар, ағын цитометрия. Артықшылығы және шектеудi келтiрдi. Технология xMap қолдануының мысалы ғылыми-зерттеу зертханадакелтiрiлген.

Сведения об авторе:

Ахмалтдинова Людмила Леонидовна

Научный сотрудник лаборатории коллективного пользования Карагандиснкого государственного медицинского университета, кандидат медицинский наук

Адрес: 100000, г. Караганда, ул. Гоголя, 40. КГМУ

Тел. рабочий +7 7212 51 38 97 (добавочный 149, 178)

E-mail:  immunol.lab@gmail.com