МЕТОДОЛОГИЯ ОПРЕДЕЛЯЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭТИОЛОГИЧЕСКОГО ДИАГНОЗА ИНФЕКЦИЙ

Аннотация

Описаны методологические аспекты диагностики этиологии инфекций. Наиболее сложное и слабое звено такой диагностики — комплексная интерпретация лабораторных результатов (что обнаружено в анализируемой пробе) и, клинических/эпидемиологических данных. Радикальное улучшение ситуации требует серьезного улучшения системы подготовки врачей соответствующих профилей.

Ключевые слова: инфекции, диагностика, этиология, методология.¹ Каральник Б.В. bvkkz@nursat.kz

Взаимодействие человека с другими видами организмов, в том числе патогенными для человека, отменить невозможно. Более того, для человека, как и для всех организмов, это взаимодействие – один из факторов эволюционного процесса. Задачей медицинской науки и здравоохранения является максимальное уменьшение рисков от такого взаимодействия с другими видами организмов, ограничение в необходимых случаях роли факторов естественного отбора. Опасность инфекционных заболеваний состоит не только в тяжести и исходах болезни: при отсутствии средств контроля существует, в отличие от соматических заболеваний, реальная возможность массового и быстрого распространения инфекций, поскольку их источниками чаще всего являются человек или животные. Перечень инфекционных заболеваний все время растет, в том числе благодаря выявлению инфекционной природы заболеваний, ранее не рассматриваемых как инфекционные (в утверждении «Существуют только инфекции и заболевания, инфекционную природу которых мы пока не знаем», как и в любой шутке, есть определенная доля правды). По этим и ряду других причин, инфекционная патология и ее диагностика – неизменно актуальная проблема для всего мира.

Эффективность одного из средств контроля над инфекциями — этионаправленной терапии — в значительной степени зависит от точности этиологического диагноза. Лишь немногие инфекции, характеризующиеся наличием четких патогномоничных симптомов, строго специфичных для возбудителя, могут быть этиологически диагностированы клинически. В большинстве случаев необходима надежная лабораторная верификация предварительного клинического диагноза. Такая диагностика необходима также для накопления объективной базы данных по распространенности и исходам инфекционных заболеваний, с целью своевременной разработки необходимых профилактических вакцин, а также для ограничения, хотя бы частичного, применения антимикробных/антивирусных/антипротозойных/антигельминтных препаратов широкого спектра действия, использование которых расширяет, в сравнении с препаратами более узкого спектра действия, резистентность различных патогенов к противоинфекционным препаратам.

Хотя предварительный диагноз заболевания может быть поставлен при первой встрече врача с больным, в целом, точность этиологического диагноза инфекции обеспечивается двумя последующими этапами обследования. Первый из них – постановка лабораторного диагноза. В результатах анализа сегодня указывают, что именно обнаружено в биопробе. Такой диагноз, независимо от соответствия окончательному диагнозу заболевания, который больному ставит клиницист или эпидемическому очагу – эпидемиолог, не всегда точен. Поэтому второй необходимый этап – интерпретация лабораторного результата и клинической картины заболевания/особенностей эпидемического очага. Надежность второго этапа может быть обеспечена только совместной (врач-лаборант, клиницист/эпидемиолог) профессиональной интерпретацией всех данных лабораторного и клинического/эпидемиологического анализа.

Очевидно, что качество первого, лабораторного, этапа невозможно без высокой профессиональной подготовки лабораторных работников, обеспеченности необходимыми аппаратурой и расходными материалами, оптимальных условий взятия и транспортировки в лабораторию биопроб. Это признается всеми. Но есть еще одно важное условие, несоблюдение которого сегодня может привести и нередко приводит к ошибочному лабораторному диагнозу или к его самостоятельной неверной интерпретации клиницистом/эпидемиологом.

Профессиональная подготовка и уровень врача-лаборанта в настоящее время не должен ограничиваться знанием методик анализа: только владения методиками работы недостаточно для постановки точного лабораторного диагноза. В противном случае,  врача было бы целесообразно и легко заменить автоматизированными системами. Врач-бактериолог (вирусолог, паразитолог, иммунолог – если последний занимается этиологической диагностикой инфекций) должен знать и учитывать особенности каждого патогена, его строго специфические признаки и свойства, общие с другими микроорганизмами; знать и принимать во внимание данные о патогенезе инфекций, их иммуногенезе, в том числе — о процессах элиминации возбудителя и его антигенов/нуклеиновых кислот, знать принципы всех методов этиологической диагностики, их возможности и ограничения. Важность таких знаний можно показать на очень многих примерах. Так, обнаружение антител или даже антигенсвязывающих лимфоцитов специфичности полисахарида бруцелл не во всех случаях обосновывает лабораторный диагноз бруцеллеза – этот антиген бруцелл «крестится» с полисахаридом Y.enterocolitica серотипа О9; то же относится к диагностике этих инфекций по индикации антигенов названных возбудителей или по результату ПЦР. Другой пример — обнаружение антигена любого возбудителя в выделениях пациента может иметь место достаточно долго после исчезновения клинических проявлений – накопленный за время заболевания чужеродный антиген (ретенция) может достаточно долго элиминироваться из организма.

Правильное представление о динамике антителогенеза давно определило более надежный подход к выявлению этиологии заболевания по обнаружению антител – не однократное, а в динамике исследование сыворотки в подходящие сроки: нарастание активности (содержания) антител или обнаружение смены антител изотипа M антителами изотипа G существенно надежнее однократного выявления антител, независимо от обнаружения, так называемого диагностического титра.

Необходимо также учитывать особенности обследуемого пациента: например, положительный результат определения антител изотипа G в агглютинационных, иммуноферментных и некоторых других тестах у беременных очень часто является ложным и требует лабораторной верификации другими методами. Это давно и хорошо известно при диагностике сифилиса (частое выявление так называемых биологических ложноположительных результатов) и подтверждено нами по данным верификации диагноза методом определения АСЛ и фактом исчезновения «положительных» результатов микрореакции, РСК и ИФА на IgG вскоре после родов, даже если женщина не получала этиотропного лечения во время беременности (5, 8, 11). Аналогичные данные получены при обследовании беременных на листериоз и бруцеллез (7, 9). Отсутствие антител специфичности предполагаемого возбудителя у детей первых лет жизни может быть связано с возрастной незрелостью иммунной системы, а обнаружение таких IgG у детей первых 3 – 6 месяцев, в отличие от обнаружения антител изотипа M, как правило, является результатом трансплацентарного переноса материнского иммуноглобулина G ребенку, а не его инфицирования.

Очень распространено отношение к выделению возбудителя как к «золотому стандарту» диагностики. Такой подход был сомнительным даже более ста лет назад, когда была сформулирована триада Генле-Коха, предназначенная для установления этиологической роли бактериального изолята при том, или ином заболевании. Выделение патогена из крови, конечно, свидетельствует о его этиологической роли, но выделение из таких биопроб как мазок из зева, влагалища, из фекалий может быть результатом носительства, а не данного заболевания. Кроме того, некоторых возбудителей и сегодня мы не умеем выделять, а для выделения многих требуется достаточно долгое время. Чувствительность выделения многих возбудителей довольно низкая и, кроме того, зависит от применения этионаправленных лекарств, периода заболевания и т.д. С этими ограничениями приходится считаться. Серьезные трудности возникают во многих случаях и при дифференциации значения изолята как показателя здорового носительства или причины данного конкретного случая болезни. В еще большей мере ограничены возможности методов обнаружения возбудителя без его выделения (например, бактериоскопия мокроты для диагноза туберкулеза или мазков из зева для диагноза дифтерии и т.д.).

Обнаружение в выделениях таких «свидетелей» патогена, как его антигены или индикация фрагментов нуклеиновых кислот в органах и тканях может оказаться результатом не текущей инфекции, а длящегося процесса его элиминации из организма. Например, антигены шигелл или сальмонелл достаточно долго после перенесенной инфекции продолжают обнаруживаться в выделениях (фекалиях, моче, даже слюне). Обнаружение антигенов вирусов гепатитов во многих органах, с завидным постоянством расцениваемое как проявление внепеченочных поражений при этих заболеваниях, может быть результатом захвата тканевыми макрофагами чужеродного антигена в процессе его удаления из организма.

Врачу-лаборанту нужно знать принципиальные особенности каждого лабораторного метода этиологической диагностики инфекционных болезней. В агглютинационных тестах (прямой и непрямой или пассивной агглютинации) и тестах, основанных на связывании комплемента, определяется совместная активность антител изотипов IgM и IgG, причем удельная (на одну молекулу) активность IgM больше, чем IgG. В реакциях преципитации участвуют IgG,  и  если такие тесты проводят в жидкой среде или в полужидком геле, также IgM. Важно знать, что в ряде серологических тестов, основанных на взаимодействии антиген-антитело, при существенно-неэквивалентном соотношении гомологичных антигена и антител может иметь место эффект прозоны. Получаемый в результате этого при неразвернутой постановке (без применения ряда последовательных разведений анализируемой сыворотки) отрицательный результат реакции взаимодействия антигена и антител может быть верифицирован только при развернутой постановке теста. Поэтому только положительный результат агглютинации на стекле надежен, а отрицательный имеет предварительный характер и требует обязательной проверки.

Отличие метода ИФА (энзимсвязанный иммуносорбентный анализ — ELISA) от вышеназванных методов (если в последних не используют принцип Кумбса) заключатся не только в возможности количественного измерения содержания антител, но и в возможности определения изотиповой активности антител (применение изотипспецифических тест-систем). Принципиальным отличием метода АСЛ от методов определения антител, особенно IgG изотипа, является возможность очень ранней диагностики и раннего контроля эффективности лечения, так как АСЛ после антигенного стимула появляются и исчезают, сравнительно с антителами, очень рано (1, 3, 6, 10). В последние годы показано, что оценка динамики АСЛ позволяет обеспечить еще одну, прогностическую, возможность в отношении более позднего, антительного ответа (2). Важные особенности метода АСЛ — надежная возможность верификации положительных результатов определения антител при беременности, а также возможность диагностики инфекционного заболевания в очень раннем возрасте, даже в периоде новорожденности, так как АСЛ в онтогенезе появляются тоже очень рано.

С нашей точки зрения, правильная интерпретация лабораторного результата во многих случаях затруднена или даже невозможна без пересмотра подхода некоторых производителей диагностических реагентов к составлению инструкций для пользователя. В них важно приводить не только алгоритм анализа и качественные или количественные параметры положительного результата, но и данные, позволяющие подготовленному врачу-лаборанту понять и отразить в выдаваемом результате таксономическую характеристику положительного результата анализа. Например, без знания основных аспектов технологии получения антигена — принципа (выделение из патогена или рекомбинантная технология, или химический синтез), соответствия свойств природному антигену возбудителя, степени чистоты, без понимания перекрестных связей между использованным в реагенте антигеном и антигенами других микроорганизмов. Точно так же без понимания того, что у обследуемого человека могут быть антитела к антигенам микробов, применяемых в рекомбинантных технологиях в качестве продуцента нужного антигена (например, Escherichia или Pseudomonas), надежность таксономической оценки положительного результата при недостаточной очистке рекомбинантного продукта от антигенов клетки-продуцента невозможна (4). Сходная ситуация может иметь место в ПЦР-анализе, если праймеры в диагностической системе не являются строго специфичными для предполагаемого возбудителя. Из вышесказанного понятно, что в подготовке инструкций по применению препаратов для диагностики in vitro должны участвовать не только биотехнологи, но и другие профессионалы — микробиологи, вирусологи, паразитологи, иммунологи.

На втором диагностическом этапе необходимо ориентироваться не только на клинико-эпидемиологические особенности конкретного случая заболевания и/или автоматически учитывать результаты лабораторной диагностики, но и вместе с соответствующим врачом-лаборантом обсудить результаты диагностики на обоих диагностических этапах с обязательным учетом полноценных характеристик диагностических препаратов.

Изложенные положения по методологии диагностики инфекций схематически отражены на рисунке 1.

Только высокий профессионализм всех участников диагностического процесса — разработчиков диагностических препаратов и инструкций по их применению, лабораторных работников и клиницистов, а при эпидемиологических расследованиях — эпидемиологов, и их взаимодействие позволит обеспечить надежность диагностики заболевания у конкретного больного и инфекции в эпидемическом очаге, и тем самым обеспечить наиболее эффективное лечение инфекционных больных, получение репрезентативной базы данных по заболеваемости для наиболее эффективной организации профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Рисунок 1.

Методологии диагностики инфекций 

Условия надежности этиологической диагностики инфекций

Литература

1. Каральник Б.В., Денисова Т.Г., Жунусова Г.Б. и др. Особенности и возможности иммунодиагностики инфекций по определению антигенсвязывающих лимфоцитов // Материалы Всеросс. научн. конф. с междунар. участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство, применение».-2005.-ч.2.-Уфа.-с.197 – 198
2. Каральник Б.В., Денисова Т.Г., Евсеев Г.А. Оценка динамики ранней фазы антигенспецифического ответа, как способ прогнозирования эффекторного иммунного ответа // Астана Медициналык Журналы.-2011.-№2.-с.189 – 192 
3. Каральник Б.В., Дерябин П.Н., Денисова Т.Г. и др. Антигенсвязывающие лимфоциты в динамике иммунного ответа на бактериальные, вирусные и аутоантигены // Известия МОН РК. Сер. биол. и мед.-Алматы.-2001.-№5.-с.37 – 43
4. Каральник Б.В., Рязанова Г.Л., Шуратов И.Х. Причины ложноположительных результатов ИФА с рекомбинантными препаратами на ВИЧ-инфекцию // Ж. микробиол.-М.-1991.-№9.-с.32 – 33
5. Пшеничная Л.А., Каральник Б.В., Тимиргалиев С.А. и др.  Информативность лабораторных тестов в диагностике сифилиса у беременных // Вопросы дерматологии и венерологи. — Алматы. — 2002.-.3  .-С.4 – 7
6. Садыкова А.М., Каральник Б.В., Денисова Т.Г. и др. Сравнительная оценка эффективности бактериологического метода и методов регистрации антигенспецифического ответа в диагностике дизентерии Флекснер и Зонне // Гигиена, эпидемиология и иммунобиология. — Алматы. — 2009.-№4.-с.172 – 178
7. Славко Е.А., Денисова Т.Г., Каральник Б.В. Иммунологическая диагностика листериоза у беременных // Family Health in the XXI Century, Papers of the XIV Internat. Sci.Conference. — P.2.-Rimini-Perm.-2010.-p.202 – 205
8. Утегенова А.К., Каральник Б.В, Диагностика сифилиса у беременных, рожениц и их новорожденных и контроль излеченности методом выявления антигенсвязывающих лимфоцитов // Гигиена, эпидемиология и иммунобиология. — Алматы. — 2003.-№2.-с.101 – 104
9. Denisova T.G., Karalnik B.V., Duysenova A.K. Characteristic features of immunological diagnosis of brucellosis in pregnant women // Development of Internat. Colloboration in Infectious Diseases Research. Internation. Conference.-Sosnovka.-Russia.-2004.-p.89
10. Karalnik B.V., Denisova T.G. Immunomodulation and stages of antigen specific response on herpes antigens//Medimond Internation.Proceed.- 2011.-p.231 – 235
11. Karalnik B.V., Pschenichnaya L.A., Utegenova A.K. The pregnancy and syphilis diagnostics by determination of antigen binding lymphocytes (ABL) of treponemal specificity // Abstracts. of 11 European Academy of Dermatology and Venerology. Prague.-Chech. Republic.-2002.-p.34