+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2225-806X

ЛАБОРАТОРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ КАРБАПЕНЕМАЗА-ПРОДУЦИРУЮЩИХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Автор: Бабенко Д.Б., Лавриненко А.В., Захарова Е.А., Шамбилова Н.А., Азизов И.С.
Место работы: Карагандинский государственный медицинский университет

Введение

Резистентность микроорганизмов к антибактериальным препаратам, используемым в клинической практике, является проблемой планетарного масштаба. На сегодняшний день наиболее важным вопросом, требующего немедленного рассмотрения является резистентность к бета-лактамным антибактериальным препаратам, которые относятся к основным антибиотикам, используемым на современном этапе. Карбапенемы, которые являются препаратами выбора при лечении ряда серьезных инфекций, вызванных мульти-резистентными штаммами грам-негативных бактерий. В тоже время, сообщения об устойчивых штаммах к карбапенемам ставят под угрозу эффективность их применения [1, 2].

Наблюдаемая глобальная экспансия генов резистентности требует умения детектировать их в лабораторной практике и является ключевым моментом в ограничении дальнейшего их распространения [3-5]. Возможности раннего выявления продукции карбапенемаз являюся принципиально важным ключевым звеном при разработке системы мероприятий по сдерживанию карбапенемрезистентнх штаммов микроорганизмов в стационарах и внешней среде [6].

Эпидемиология плазмид резистентности.

В начале 60-х гг. появилось сообщение, указывающее на ассоциацию резистентности бактерий с наличием плазмид [7]. На сегодняшний день установлено, что большинство генов, обеспечивающие множественную лекарственную устойчивость располагаются на R плазмидах – молекуле ДНК изолированное от хромосомы бактерии. Процесс передачи плазмид от одной бактерии к другой осуществляется, главным образом, посредством конъюгации. Способность конъюгации обеспечивать передачу генов устойчивости среди различных микроорганизмов вызывает одну из главных клинических проблем.

В связи с тем, что большинство генов резистентности мобильны, возникшая ситуация глобального распространения устойчивости к антибактериальным препаратам приобрела название «чума плазмид» (“plague of plasmids”) [8].

Показательным случаем является описание продукции карбапенемазы KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) у штамма K.pneumoniae в 2001 году [9]. Почти сразу же появились сообщения об обнаружении аналогичных карбапенемаз среди представителей Enterobacteriaceae, (K.oxytoca Escherichia coli, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Enterobacter spp, Serratia spp и Salmonella spp.) и Pseudomonas aeruginosa [10-16], которые очень быстро распространились по всему миру – Южная Америка, Северная Америка, Греция, Израиль, Пуэрто -Рико, Китай и т.д. [17-21].

Ситуация сильно напоминает пандемию, связанную с распространением СТХ-М бета-лактамаз, которые занимают лидирующую позицию. Цефотаксимазы CTX-M являются наиболее быстро растущей группой ESBL и насчитывают свыше 100 вариантов ферментов на сегодняшний день (http://www.lahey.org/Studies). Данные ферменты также детектируются в различных штаммах грам-негативных микроорганизмов — Klebsiella pneumoniae [22, 23], Proteus mirabilis [22], Escherichia coli [24, 25], Salmonella enterica [26], Acinetobacter baumannii [27], Citrobacter freundii [28], Pseudomonas auruginosa [29-30], Klebsiella oxytoca  [31] и вносят колоссальный вклад в распространение бета-лактамной резистентности по всему миру – Китай [32],  Индия [33], Япония [24], США [34], Саудовская Аравия [35], Болгария [36], Новая Зеландия [37], Великобритания [38], Тунис [39], Южная Америка [26], Нигерия [40], Шотландия [23], Корея [41], Гаити [27], Танзания [42], Венесуэла [28], Германия [43].

С момента открытия бета-лактамаз SHV-2 в 1983 число сообщений о выявлении данной группы ферментов резистентности продолжает расти [44, 45]. На сегодня насчитывается свыше 20 разновидностей SHV бета-лактамаз описанных в литературе [46, 47], а также представлены в Интернете на сайте http://www.lahey.org/studies/webt.htm. Гены, экспрессирующие данные энзимы располагаются на плазмидах, что позволяет им достаточно легко распространяться как среди представителей одного вида, так и между видами [48]. К настоящему моменту данные гены детектированы среди распространенных патогенов таких как Klebsiella sp., Escherichia sp. and Salmonella sp. [49], а также среди других представителей семейства Enterobacteriaceae. Есть сообщения о выявлении гена blashv у Р. aeruginosa [50].

Эпидемиология карбапенемаза-продуцирующих грамнегативных бактерий.

Большинство международных руководств позиционирует P.auruginosa [51-58], K.pneumoniae [59-65], А.baumannii [66-70], как наиболее распространенных патогенов, вызывающих внутрибольничные вспышки. Спектр бета-лактамаз, обнаруженных у штаммов P.aeruginosa, K.pneumoniae и A.baumanii крайне широк и включает представителей из всех четырех классов –  А, B, C, D. Так, у синегнойной палочки были обнаружены IMP [71], VIM [72], KPC [73, 74], GIM[75], PER [76, 77], OXA[78], PME-1 [79], NDM-1 [80], SHV [81], VEB[82], GES [83, 84] многие из которых обладают карбапенемазной активностью. K.pneumonia также является представителем с большим количеством обнаруженных карбапенемаз – IMP [85], NDM-1 [86, 88], KPC [89, 90], OXA [91, 92], VIM [93, 94], SHV [32, 95, 96], DHA [97], CMY [98, 99]. Аналогичная ситуация характерна и для A.baumanii, у которой были обнаружены карбапенемазы представители 3 классов (А, В, D) – KPC [100], GES [101, 102], SHV [103], TEM [104, 105], IMP [106, 107], PER [108, 109], SIM [110], OXA [11-112], NDM [113], VIM [114-116], VEB [117, 118]. При этом, согласно литературным источникам наблюдаются случаи с сочетанной карбапенемазной активностью, когда у одного патогена детектируются несколько генов с различной карбапенемазной активностью [89, 119-124].

Данные о географической распространенности бета-лактамаз, в том числе карбапенемаз P.aeruginosa, K.pneumonia и A.baumannii представленны в таблице 1.

Таблица 1. Географическая распространенность генов резистентнсти (бета-лактамазы, включая карбапенемазы) P.aeruginosa, K.pneumonia и A.baumannii.

скачать таблицу: tablica-1.-geograficheskaya-rasprostranennost-genov-rezistentnsti-beta-laktamazy-vklyuchaya-karbapenemazy-p.aeruginosa-k.pneumonia-i-a.baumannii..pdf [123,48 Kb] (cкачиваний: 51)

Очевидно, что распространенность резистентности приобрела глобальный масштаб, затрагивая все континенты земного шара. При этом наблюдается устойчивая тенденция к росту случаев обнаружения штаммов продуцирующих бета-лактамазы, включая ферменты с карбапенемазной активностью, как среди клинических штаммов, так и среди микроорганизмов, обитающих в окружающей среде [203-206].

Детекция карбапенемаз методом полимеразной цепной реакции.

На сегодняшний день существуют различные фенотипические и молекулярно-генетические методы детекции карбапенемаз. В тоже время многие из них обладают ограничениями, в частности, как скрининг-методы. Например, в 2009 году в руководстве CLSI (M100) было рекомендовано использовать метод MHT (метод Hodge тестирования) с целью детекции КРС продуцирующих микроорганизмов в связи с абсолютными показателями теста — 100% чувствительностью и 100% специфичностью [207]. Позже Wang с соавторами показали, что возможны ложно-положительные результаты при определении карбапенемаз у ESBL-продуцирующих изолятов [203]. Также при использовании данного метода требуется обученный персонал для проведения и интерпретации результатов. К тому же, являясь фенотипическим методом, возникает потребность и во времени. Временная затрата на получение результата составляет не менее 24 часов. Все это не позволяет использовать метод МНТ в скрининге.

Широкое распространение получил метод детекции метало-беталактамаз с помощью 10мМ раствора ЭДТА [208]. Однако, на зону задержки роста оказывают влияние такие факторы как уровень экспрессии генов металло-беталактамаз, снижение поринов внешней мембраны и гиперэкспрессия системы эффлюкса [209].  В своей работе Chu Y.W. с соавт. [210] показали возможность получения ложных результатов при детекции металло-беталактамаз у P. aeruginosa Etest и imipenem–EDTA дисковым методам.

В сложившейся ситуации альтернативным подходом в детекции карбапенемазной активности у микроорганизмов является молекулярно-генетическое определение генов резистентности, позволяя избежать сложности, возникающие при использовании фенотипических методов.  

Широкое распространение метода ПЦР в лабораторной практике, связанное с простотой метода, его высокой специфичностью и чувствительностью нашло свое место и при разработке методов быстрой индикации и идентифкации генов лекарственной устойчивости микроорганизмов. На сегодняшний день накоплен большой опыт в данном направлении, что позволило нам объединить результаты многочисленных исследований в одной таблице №3, в которой включены основные праймеры для детекции карбапенемаз трех классов — А, B и D

.

Таблица№3 Основные праймеры для детекции генов резистентности методом ПЦР

ФерментыМолеку-лярный классПраймеры 5′→3′Количество пар основанийTm (C0)*
Размер ампликонов (пар оснований)источник
GESАCTATTACTGGCAGGGATCGCCTCTCAATGGTGTGGGT191860.858.7594[211]

KPC
АTCGCTAAACTCGAACAGGTTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC182462.772.1785[211]
TTGTTGATTGGCTAAAGGGCCATACACTCCGCAGGTT191859.161.9106[212]
SMEАTGTAGGTGACAARACTGGGAGCTGTGGCAATACGTGATGCTTCCGCAATAG262566.469165
[213]

ACTTTGATGGGAGGATTGGCACGAATTCGAGCATCACCAG202061.764.2551[214]
IMIАGAGGGTATGACTAAATTCATGCGGTCGAGCAGGTGTAGATGTGTCACGYTCATCG282769.770.1116213]
NMCАTGCGGTCGATTGGAGATAAACGATTCTTGAAGCTTCTGCG202063.964.9399[214]
BICАTATGCAGCTCCTTTAAGGGCTCATTGGCGGTGCCGTACAC202063.468.7537[215]
IMPBGGAATAGAGTGGCTTAAYTCTCGGTTTAAYAAAACAACCACC222060.158.1232[215,216]
ACCGCAGCAGAGTCTTTGCCACAACCAGTTTTGCCTTACC20206861.8587[217]
VIMBGTTTGGTCGCATATCGCAACAATGCGCAGCACCAGGATAG202065.465.5382[211]
GATGGTGTTTGGTCGCATACGAATGCGCAGCACCAG191760.865.9390[215,216]
SPMBCTAAATCGAGAGCCCTGCTTGCCTTTTCCGCGACCTTGATC212064.766.3798[218]
AAAATCTGGGTACGCAAACGACATTATCCGCTGGAACAGG202064.962.8271[215,216]
GCGTTTTGTTTGTTGCTCTTGGGGATGTGAGACTAC181861.556.4786[217]
GIMBTCGACACACCTTGGTCTGAAAACTTCCAACTTTGCCATGC202062.662.2477[215,216]
SIMBGTACAAGGGATTCGGCATCGTGGCCTGTTCCCATGTGAG201965.461.8569[218]
TACAAGGGATTCGGCATCGTAATGGCCTGTTCCCATGTG192064.161.1570[215, 216]
DIMBGCTTGTCTTCGCTTGCTAACGCGTTCGGCTGGATTGATTTG212068.164.5699[215]
AIMBCTGAAGGTGTACGGAAACACGTTCGGCCACCTCGAATTG201961.965.9322[215]
NDMBTTGGCCTTGCTGTCCTTGACACCAGTGACAATATCACCG182161.961.682[211]
GGTTTGGCGATCTGGTTTTCCGGAATGGCTCATCACGATC202063.964.3621[215]
GCGCAACACAGCCTGACTTTCAGCCACCAAAAGCGATGTC202067.165.1155[219]
OXA-5DAGCCGCATATTTAGTTCTAGACCTCAGTTCCTTTCTCTAC202060.758.7664[220]
OXA-18DCGATTACGGCAACAAGGATTAGGCGGGCGAAGACGA181862.969.4322[220]
OXA-23DGACACTAGGAGAAGCCATGAAGCAGCATTACCGAAACCAATACG22226265.2116[221]
OXA-24DGATGACCTTGCACATAACCGCAGTCAACCAACCTACCTGTG202161.961.4151[221]
OXA-48DTGTTTTTGGTGGCATCGATGTAAMRATGCTTGGTTCGC191961.161.7177[211]
DGCGTGGTTAAGGATGAACACCATCAAGTTCAACCCAACCG202062.962.3438[215]
OXA 51DTGTCTAAGGAAGTGAAGCGTGAACTGTGCCTCTTGCTGAG211963.361.2112[221]
OXA 58DAAGATTTTACTTTGGGCGAAGCCAACTTCCGTGCCTATTTGC222065.264.1141[221]
OXA-51-likeDTAATGCTTTGATCGGCCTTGTGGATTGCACTTCATCTTGG202062.859.3353[221]
OXA-23-likeDGATCGGATTGGAGAACCAGAATTTCTGACCGCATTTCCAT202061.461.3501[223]
OXA-24-likeDGGTTAGTTGGCCCCCTTAAAAGTTGAGCGAAAAGGGGATT202063.663.7246[223]
OXA-58-likeDAAGTATTGGGGCTTGTGCTGCCCCTCTGCGCTCTACATAC202062.765.1599[223]
OXA-143DTGGCACTTTCAGCAGTTCCTTAATCTTGAGGGGGCCAACC202063.363.7149[224]

*  Основан на методе Wetmur and Sninsky nearest-neighbor base interaction при стандартных условиях ПЦР реакции (0,4мкмоль праймеров, 0,05М К+ и 2,5мМ Mg2+)

Вследствие способности клинических штаммов продуцировать несколько карбапенемаз, а также высокого разнообразия и постоянного появления новых вариантов генов резистентности метод мультиплексной ПЦР детекции становится наиболее актуальным, в том числе и при скрининге микроорганизмов с карбапенемазной актвивностью [225, 226].   Так в работе Woodford N. и соавт., был предложен вариант мультиплексной ПЦР для обнаружения генов OXA-карбапенемаз четырех филогенетических подгрупп — OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, и OXA-58 у представителей рода Acinetobacter.  Вследствие хорошего различия в размерах получаемых ампликонов, продукты амплификации удобно анализировать электрофоретически в агарозном геле [226].

В 2010 г. Higgins P.G. с соавт. [225] развили методику мультиплексной ПЦР по выявлению генов OXA карбапенемаз, добавив праймеры для детекции OXA-143 — новый вариант ОХА карбапенемаз, выявленная в 2009 г.[227].

Успешной попыткой разработать мультиплексный вариант ПЦР в режиме реального времени оказалось работа Chen L. с соавт. в 2011 г. [228] в которой с помощью 2 пар праймеров и 6 различных молекулярных маяков (molecular beacons) определили наличие генов bla KPC — bla KPC-2-11.

Группа исследователей под руководством Laurent Poirel  взяв за основу работу Ellington M.J. (2007) разработали и оптимизировали мультиплексную ПЦР детекцию генов карбапенемаз 3 основных классов – А, В и D,  позволяющая обнаружить до 11 карбапенемаз после электрофоретического разделения продуктов амплификации [215].  К 2012 г.  Xiao-Zhe Huang с соавт. впервые разработали быстрый метод детекции генов карбапенемаз D класса (blaOXA-23, blaOXA-24/40, blaOXA-51 и blaOXA-58) на основе мультиплексной ПЦР с использованием флюоресцентных меток TaqMan [221].

На наш взгляд, наиболее технологически продвинутый методический подход мультиплексной ПЦР детекции генов карбапенемаз среди грам-негативных микроорганизмов был разработан Jussimara Monteiro и др. (2012г.)[211].  Ранее предложенные методы выявления генов резистентности мультиплексной ПЦР обладали ограничениями — мультиплексные варианты ПЦР в режиме реального времени позволяли детектировать гены либо серин-содержащих карбапенемаз, либо метало-β-лактамаз [229, 230]. В других же работах, где определялось более одного класса карбапенемаз, использовались традиционные ПЦР методы [231, 232], а продукты амплификации определялись электрофоретически [215]. Авторы разработали мультиплексную ПЦР в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавлений для детекции генов 6 различных типов карбапенемаз (KPC, GES, NDM, IMP, VIM и OXA-48) идентифицированных среди представителей семейства Enterobacteriaceae, а также Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa. Данная методика характеризовалась высокими параметрами чувствительности и специфичности и высокой экономической эффективностью. При этом, время затрачиваемое на полное проведение исследования, включая выделение ДНК, приготовление пробы, проведение мультиплексной ПЦР и анализа результата не превышает 3 часов. Все это позволяет использовать данную методическую разработку в рутиной лабораторной практике, а также скрининге основных генов резистентности.

Особенности генетики мультирезистентных штаммов микроорганизмов показали, что на данный момент крайне сложно предотвратить появление таких бактерий и ранняя лабораторная детекция генов резистентности является критически важным моментом в предотвращении дальнейшего их распространения. Вместе с этим, развитие технологий генного и геномного анализа позволяет ожидать в ближайшее время появление новых подходов в детекции мультирезистеных форм микроорганизмов. 

Скачать список использованной литературы: spisok-ispolzovannoy-literatury.pdf