Длительное сохранение микобактерий туберкулеза (МТ) необходимо для проведения научных исследований, изучения механизмов лекарственной устойчивости, разработки и тестирования новых лекарств, вакцин, методов диагностики, а также для определения биомаркеров, создания музея культур [1]. Для хранения культур микроорганизмов необходимо проводить их консервацию. Эффективность консервации оценивается по выживаемости бактерий, которая определяется по результатам культивирования на питательных средах после длительного хранения [1, 2, 3]. Цель исследования – разработка методики и оценка эффективности криоконсервации и лиофильной сушки микобактерий туберкулеза (МТ). В задачи исследования входили: оптимизация существующей методики лиофилизации [4], определение наиболее рентабельного пути консервации, применение в микробиологической лаборатории противотуберкулезного диспансера, сокращение трудо-временных и материальных затрат при консервации, проверка эффективности методики с помощью контроля качества.
Материалы и методы
Микобактерии высевали из мокроты больных туберкулезом. Сбор мокроты проводили утром натощак до приема лекарственных средств. Отобранную мокроту смешивали с равным объемом 4% NaOH, встряхивали на шейкере (GFL 3005, Германия) 15 минут при частоте встряхивания 20 с-1 (120 колебаний в минуту) и амплитуде встряхивания 20 мм, затем центрифугировали при 314,2 рад/с (3 000 оборотов в минуту) в течение 15 минут и 0,25 мл осадка засевали на скошенный агар Левенштейна-Йенсена. Выращенные культуры микобактерий тестировали на лекарственную чувствительность, затем консервировали путем лиофилизации и замораживания. Лиофилизацию проводили с помощью аппарата для лиофильной сушки ALPHA 1-2 LD-plus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия). Криоконсервацию проводили замораживанием суспензии микобактерий в защитной среде при температуре -18˚С. Консервации подвергали культуры, с момента появления роста которых прошло не более двух месяцев. Для приготовления суспензии микобактерий все колонии со скошенного агара Левенштейна-Йенсена тщательно собирали петлей в стерильную пробирку со стеклянными бусами и 0,5 мл защитной среды, суспендировали, добавляли 7,0 мл защитной среды, перемешивали встряхиванием. Суспензию разливали по 1,0 мл в пластиковые микропробирки, например, типа Eppendorf для ИФА и ПЦР. Контроль качества проводили путем определения выживаемости консервированных культур и остаточной влажности лиофилизированных культур. По остаточной влажности судили о полноте высушивания при лиофилизации. Высушивание считается достаточным, если остаточная влажность лиофилизированных культур не превышает 6,0% [4]. Жизнеспособность микобактериальных клеток определяли путем высева на скошенный агар Левенштейна-Йенсена до и после лиофилизации. Для этого 0,5 мл суспензии микобактерий вносили в пробирку с 4,5 мл физиологического раствора, перемешивали, титровали до разведения 10-5, затем высевали из каждого разведения по 0,75 мл на питательную среду. Флаконы с лиофилизированными и криоконсервированными культурами хранили в холодильнике при температуре -18˚С.
Результаты
Основной задачей исследования было адаптировать методику консервации микобактерий к условиям микробиологической лаборатории противотуберкулезного диспансера. Исходя из этого, был определен минимальный набор оборудования для успешного осуществления лиофилизации и криоконсервации: аппарат для лиофильной сушки с вауумным насосом, автоклав, термостат, весы аналитические, электроплита, сушильный шкаф, ламинарный бокс, холодильник с морозильной камерой (до -20˚С). Этот набор оборудования входит в минимальный стандарт оснащения медицинской техникой и изделиями медицинского назначения для противотуберкулезных больниц (диспансеров) областного уровня по приказу МЗ РК № 586 от 04.12.2006 [5].Для предотвращения повреждения бактериальных клеток при замораживании и лиофилизации использовали защитные среды. С целью оптимизации процесса вместо дорогих коммерческих защитных сред, рекомендуемых в литературе [4, 6, 7, 8, 9], использовали недорогие защитные среды собственного приготовления. Наиболее эффективной защитной средой для лиофилизации оказалась желатиновая среда с сахарозой. Эта среда идеально подходит для лиофилизации в обычной лаборатории с ограниченными ресурсами. Для ее приготовления размешивают 3 г желатина и 2 г сахарозы в 100 мл дистиллированной воды (или молочной сыворотки), прогревают до 70-90˚С до полного растворения желатина, стерилизуют автоклавированием при температуре 121˚С и давлении 151,99 кПа (1,5 атм) в течение 15 минут. Эта же среда подходит и для криоконсервации культур. Если же в лаборатории нет аппарата для лиофильной сушки или лиофилизация бактерий не планируется, то для криоконсервации лучше использовать защитную среду из смеси 10 мл обезжиренного молока (1-1,5%) и 2 мл глицерина.При исследовании использовали пластиковые микропробирки в качестве контейнеров для консервации и хранения культур. Пластиковые микропробирки в бактериологии достойны более широкого применения. Они используются в молекулярно-генетических исследованиях, серологиии и обладают рядом достоинств: имеют прочно закрывающуюся крышечку, надежно защищающую от протекания, выдерживают режим автоклавирования при давлении в 151,99 кПа (1,5 атм), имеют невысокую стоимость (3-4 тенге за штуку). Наш опыт использования показал, что микропробирки хорошо подходят для консервации и транспортировки микроорганизмов. Хранить биологически опасные материалы, каковыми являются суспензии микобактерий, рекомендуется в плотно закрывающихся контейнерах в соответствии с санитарными правилами «Санитарно-эпидемиологические требования к лабораториям», утвержденными постановлением Правительства Республики Казахстан от 10 января 2012 г.ода №13. Поэтому культуры помещали для хранения в пластиковые контейнеры с плотно закрывающейся крышкой. В работе использовали стерильные контейнеры объемом 120,0 мл для мочи (производитель F.L.Medical S.r.l., Италия). По методике, рекомендованной производителем аппаратов лиофильной сушки, необходимо предварительно замораживать культуры до -70˚С. Однако, при отсутствии в лаборатории холодильника глубокой заморозки, можно проводить предварительное замораживание культур в морозильной камере обычного бытового холодильника при температуре -18˚С в течение 15-18 часов (оставить на ночь). Затем сразу проводить лиофильную сушку. Это позволит проводить лиофильную сушку в тех лабораториях, которые не оснащены холодильником глубокой заморозки. В процессе исследования был подобран оптимальный режим лиофилизации микобактерий, позволяющий завершить процесс в течение рабочего дня: • основная сушка – 5 часов при температуре -40˚С и остаточном давлении 12 Па (0,12 мбар);•окончательная сушка – 3 часа при температуре -50˚С и остаточном давлении 4 Па (0,04 мбар).Результаты контроля качества лиофилизации по остаточной влажности показали, что при выбранном режиме лиофильной сушки достигается допустимый уровень остаточной влажности (в среднем 5,2±0,5%). Для контроля выживаемости проводился высев суспензии микобактерий на скошенный агар Левенштейна-Йенсена. Были апробированы различные посевные дозы суспензии (от 0,1 до 1,0 мл). Лучшие результаты были получены при засеве по 0,75 мл суспензии. Это в три раза больше, чем обычно рекомендуется для засева микобактерий на плотные среды. Засеянные пробирки инкубировали 1-3 cуток в термостате при 36±1˚С в горизонтальном положении, затем упаковывали в закрытый пластиковый пакет и инкубировали до 8 недель с еженедельным контролем роста. При таком способе посева и инкубации создается достаточный уровень влажности, который предотвращает высыхание среды и позволяет культивировать микобактерии на плотных средах в обычных биологических пробирках с ватно-марлевыми пробками. Не нужно парафинировать пробки или покупать специальные пробирки с завинчивающейся крышкой.На данном этапе исследования лиофилизировано и криоконсервировано 236 штаммов МТ от 68 испытуемых. Число жизнеспособных клеток микобактерий в каждом флаконе до лиофилизации составляла от 102 до 108 колониеобразующих единиц (КОЕ) (в среднем 2,56 x 107 КОЕ). После хранения в течение 6 месяцев жизнеспособность изменялась незначительно: в среднем составляла 1,01 x 107 жизнеспособных клеток во флаконе. Результаты контроля выживаемости микобактерий при лиофилизации представлены на рисунке 1.
Рис. 1. Результаты контроля выживаемости МТ при лиофилизации Флаконы с лиофилизированными культурами можно хранить до 15 лет в низкотемпературном холодильнике при температуре -70˚С. Допускается хранение в холодильнике при температуре -18˚С в течение 3-5 лет с ежегодным контролем жизнеспособности культур, а также при комнатной температуре – в течение года с последующим контролем жизнеспособности и свойств микробов [4, 6, 7].Расчет стоимости реагентов и расходных материалов показал, что для консервации 1 культуры МТ по вышеописанной методике необходимо 226 тенге. Это в среднем на 30-40% дешевле, чем в методиках, описанных в литературе [4, 6, 7, 8].
Рентабельность достигается за счет использования:
• пластиковых микропробирок в качестве флаконов для консервации;
• защитной среды на основе желатина вместо коммерческих сред (Sauton’s medium, Triton WR 1339, твин-альбуминовая среда);
• физиологического раствора в качестве дилюента для реконституции суспензии вместо среды Dubos-Davis;
• предварительного замораживания без использования сухого льда;
• сокращения времени лиофилизации до 8 часов (вместо 28 часов [7]).
Заключение
Разработанная методика криоконсервации и лиофильной сушки МТ проверена и успешно применяется в микробиологической лаборатории ГУ «Областной противотуберкулезный диспансер» Управления здравоохранения Карагандинской области в рамках клинических испытаний. Методика рентабельна, не требует больших трудо-временных и материальных затрат, обеспечивает оценку эффективности и контроль качества консервации. По результатам работы возможно внедрение консервации микобактерий в практику противотуберкулезных диспансеров и стационаров с целью мониторинга, проведения дополнительных тестов и научных исследований.
Литература
- Shu, Z, Weigel, K. M., Soelberg, S. D., Lakey, A., Cangelosi, G. A., Lee, K. H., Chung, J. H., Gao, D. Cryopreservation of Mycobacterium tuberculosis Complex Cells. J Clin Microbiol. — 2012, Aug. 29.
- Kubica, G. P., Gontijo-Filho, P. P., and Kim, T. Preservation of mycobacteria st -70 degrees C: persistence of key differential features. J Clin Microbiol. — 1977, August.; 6(2): P. 149–153. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P…?tool=pmcentrez
- Milan Šlosárek, Jiří Šourek, Zdeňka Miková. Results of long-term preservation of Mycobacteria by means of freeze-drying Cryobiology. Volume 13, Issue 2, April 1976, P. 218–224. http://www.sciencedirect.com/science/artic…01122407690136X
- Howard Gruft, Mary E. Clark, and Mary Osterhout. Preservation of Mycobacterial Cultures . Applied Microbiology, Feb. 1968, Vol. 16, No. 2. P. 355-357 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC547411 /pdf/applmicro00238-0171.pdf
- Приказ МЗ РК № 586 от 4.12.2006 «Об утверждении минимальных стандартов (нормативов) оснащения медицинской техникой и изделиями медицинского назначения для противотуберкулезных больниц (диспансеров) областного, городского и районного уровня»
- Thomas, H. Kim and George P. Kubica. Long-Term Preservation and Storage of Mycobacteria Appl Microbiol. 1972 September; 24(3): P. 311–317.
- Yun-Ling Wong, Samantha Sampson, Willem Andreas Germishuizen, Sunali Goonesekera, Giovanni Caponetti, Jerry Sadoff, Barry R. Bloom and David Edwards. Drying a tuberculosis vaccine without freezing. Proc Natl Acad Sci USA. 2007. February 20; 104(8): P. 2591–2595. doi: 10.1073/pnas.0611430104
- Thomas H. Kim and George P. Kubica. Long-Term Preservation and Storage of Mycobacteria Appl Microbiol. 1972 September; 24(3): 311–317.
РЕЗЮМЕ
Ланкина М. В., Кутулуцкая Т. В., Оспанова Г. Т.
Ключевые слова: микобактерии, туберкулез, лиофилизация, криоконсервация.Разработана методика криоконсервации и лиофильной сушки микобактерий туберкулеза, адаптированная к условиям микробиологической лаборатории областного диспансера. Рекомендован оптимальный режим лиофилизации, защитные среды, перечень необходимого оборудования, методы контроля качества проводимых процедур.
SUMMARY
Lankina M. V., Kutulutskaya T. V., Ospanova G. T.
Key words: mycobacterium, tuberculosis, lyophilization, cryopreservation.The technique of cryopreservation and lyophilization of Mycobacterium tuberculosis was created. It was adapted to the conditions of microbiology laboratory of regional tuberculosis dispensary. Optimal regimen of lyophilization, protective media, necessary equipment, and methods of quality control were recommended.
Отправить рукопись