+7 (727) 250 00 11
+7 (776) 250 05 58

ISSN 2303-9949

ДОПУСТИМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ПРОТЕКАЮЩЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ

Автор: А. П. Момот, И. В. Молчанова, Д. Е. Белозеров, Д. А.Трухина, О. П. Томилина, И. Ю. Кудинова, Н. В. Максимова3, Н. И. Фадеева, Л. П. Цывкина, В. В. Романов
Место работы: Алтайский филиал ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава РФ, г. Барнаул (Россия) ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Минздрава РФ, г. Барнаул (Россия) КГБУЗ Краевая клиническая больница, г. Барнаул (Россия) ООО Инвитро-Сибирь, г. Новосибирск (Россия)

По результатам исследования венозной крови у 301 женщины (из них у 196 – на разных сроках физиологически протекающей беременности) определены референтные значения большинства известных параметров системы гемостаза. Обследование проводилось вне беременности, на сроке 6-8, 12-13, 22-24, 34-36 недель беременности и на 2-3-и сутки после самопроизвольных родов. Установлены допустимые интервалы для стандартных тестов коагулограммы – количества тромбоцитов в крови, их агрегационной активности, уровня тромбоцитарного фактора 4, …
активированного парциального/частичного тромбопластинового времени, протромбинового, тромбинового и батроксобинового тестов, концентрации фибриногена, активности тканевого фактора, фактора Виллебранда, факторов II, V, VII, VIII, X, XI, XII и XIII; маркеров активации свертывания крови – фактора VIIa, фибринопептида А, комплекса тромбин-антитромбин, D-димеров; физиологических антикоагулянтов – антитромбина III, протеинов С и S, ингибитора пути тканевого фактора, резистентности фактора V к активированному протеину С; участников системы фибринолиза-плазминогена, α2-антиплазмина, тканевого активатора плазминогена, урокиназного активатора плазминогена, ингибитора активатора плазминогена 1 типа, тромбин-активируемого ингибитора фибринолиза. Описана динамика интегральных показателей оценки гемостаза – теста генерации тромбина, тромбоэластометрии и пространственный рост фибринового сгустка (Тромбодинамика). Кроме того, определялся уровень гомоцистеина, эндотелина-1, антигена и активности металлопротеиназы, расщепляющей фактор Виллебранда (ADAMTS-13). Приведенные данные могут быть использованы в качестве ориентировочных при исследованиях системы гемостаза у беременных женщин и учитываться при формировании групп высокого риска по тромботическим, геморрагическим и акушерским осложнениям.

Введение
Беременность, роды, послеродовой период тестно связаны со значительной заболеваемостью и смертностью для матери и плода [1-4]. Этот период жизни женщины ассоциируется с физиологической и прогрессирующей по срокам гестации активацией свертывания крови, целесообразность которой связывается с необходимостью снижения кровопотери в родах. Однако вынашивание беременности и послеродовой период определены в качестве доказанных факторов риска развития венозных тромбозов и тромбоэмболии легочной артерии, с частотой в 4-50 раз выше по сравнению с небеременными женщинами [5-7]. С другой стороны, маточные кровотечения – это события обычные для всех этапов беременности, массивные же акушерские кровотечения являются опасным, угрожающим жизни осложнением у многих женщин [1,8,9].

Существует определенный парадокс: анализу системы гемостаза при ведении беременности и предупреждении ее осложнений придается большое значение, однако границы нормы и патологии на различных сроках гестации по большинству современных методов лабораторной диагностики нарушений гемокоагуляции остаются недоступными для специалистов разного профиля – врачей клинико-диагностических лабораторий, гематологов, акушеров-гинекологов и реаниматологов. Несмотря на имеющиеся обзоры в этой области [10,11], лаборатории, как правило, используют допустимые интервалы показателей, полученных на образцах плазмы крови небеременных женщин, которые не приемлемы для принятия клинических решений во время беременности [12]. Большой интерес представляют и допустимые значения показателей гемокоагуляции в первые дни после родов, поскольку они способны помочь в дифференциальной диагностике хирургических и гематологических причин кровотечений, а также отборе пациенток, нуждающихся в пролонгированной тромбопрофилактике. 

Целью настоящего исследования явилось определение референтных значений широкого спектра показателей системы гемостаза вне беременности, в различные сроки физиологически протекающей беременности и в 2-3 дня после физиологического родоразрешения. 

Материалы и методы
В рамках проспективного исследования были получены данные о 301 женщине, обследованной в женских консультациях и родильном доме № 2 г. Барнаула в период с 2011 по 2013 гг. Обследование женщин выполнялось в лаборатории патологии гемостаза КГБУЗ «Краевая клиническая больница» (г. Барнаул) при участии сотрудников Алтайского филиала ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, лаборатории гематологии ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России и лаборатории ООО «Инвитро-Сибирь», г. Новосибирск. Настоящая работа была одобрена Локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава РФ (выписка из протокола № 14 от 11.12.2013 г.), и все участники дали свое информированное согласие.

С учетом результатов клинического и лабораторного обследования проводилась консультация акушером-гинекологом, терапевтом и гематологом, после чего решался вопрос о включении женщины на том или ином сроке беременности в настоящее исследование. Учитывались данные у перво- и повторнобеременных в возрасте от 18 до 35 лет. Критерии исключения из исследования, характеристика обследованных женщин и рожденных ими детей приведены нами ранее [13].

Отобраны следующие контрольные точки для исследования системы гемостаза, учитывающие волны инвазии трофобласта и отражающие «критические» сроки беременности: прегравидарный период, 6–8 недель, 12-13 недель, 22-24 недели, 34-36 недель и 2-3-и сутки после родоразрешения. Все женщины, принятые в исследование, обследовались, как правило, однократно.

Техника
лабораторного обследования 
Взятие венозной крови осуществлялось из локтевой вены в пробирки VACUETTE с буферным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 (9NC Coagulation sodium citrate 3,2%). Кровь центрифугировали при 1400g в течение 15 мин при комнатной температуре, в результате получали обедненную тромбоцитами плазму. Для исследования функции тромбоцитов плазма крови, обогащенная тромбоцитами, получалась путем центрифугирования крови при 160 g в течение 7 мин в условиях того же температурного режима. 

Пробы плазмы исследовались в течение первых двух часов после получения. Перед проведением иммуноферментых анализов или до оценки эндогенного тромбинового потенциала по тесту генерации тромбина плазму хранили при температуре -40оС в интервале времени от одних суток до одного месяца в низкотемпературном холодильнике MDF-192 Ultra low temperature freezer (Sanyo). Для определения уровня гомоцистеина использовалась сыворотка крови, полученная с использованием вакуумных пробирок Improvacuter (Lind-Vac) без наполнителя. Число тромбоцитов определялось в стабилизированной ЭДТА крови с использованием вакуумных пробирок Improvacuter (Lind-Vac) с растворенным стабилизатором – ЭДТА К3.

В работе применялась следующая панель современного оборудования, применяющаяся в отечественных клинико-диагностических лабораториях: гематологический анализатор MEK-7222 J/K [1] (Nihon Kohden); агрегометры оптические — Chronolog 490-4D [2] (CHRONO-LOG Corporation) и AggRAM [3] (Helena Laboratories); коагулометры полуавтоматические — Helena C-1 [4], АПГ4-02П [5] (ЭМКО) и Start 4 [6] (Stago); автоматические коагулометры – STA Compact [7] (Stago) и Sysmex CA-1500 [8] (Sysmex Corporation); планшетный флюориметр Fluoroskan Ascent [9] (ThermoFisher SCIENTIFIC) с программным обеспечением «Thrombinoscope 3.0.0.26»; тромбоэластометр 4-х канальный ROTEM Gamma [10] (Rotem); иммунохимические анализаторы — IMMULITE 2000 [11] (Siemens Healthcare Diagnostics) и Architect i2000 [12] (ABBOTT LABORATORIES S.A.); фотометры — спектрофотометр Photometr 5010 v5+ [13] (Robert Riele GmbH &Co KG), микропланшетный фотометр Bio-Rad 680 [14] (Bio-Rad Laboratories); экспресс-анализатор (рефлектометр) [15] NycoCard Rider II (Axis Shield); регистратор Тромбодинамика Т-2 [16] (ГемаКор, Россия).

Примечание: в квадратных скобках отмечено оборудование, примененное в работе для выполнения тех или иных методов диагностики системы гемостаза (см. таблицу).
В ходе исследований использовались зарегистрированные в Российской Федерации тест-системы, поставляемые или производимые в нашей стране следующими фирмами: Технология-Стандарт (Россия), ГемаКор (Россия), AssayPro, St. Charles, MO, Axis-Shield, Siemens, BCM Diagnostics, Biomedica, Helena Bioscience, Rotem, Sekisui Diagnostics (American Diagnostica), Тechnoclone, Thrombinoscope BV. Анализ проводился в соответствии с инструкциями к наборам реагентов и рекомендациями ряда известных руководств в области лабораторной диагностики нарушений гемостаза [14-17]. 

В качестве контрольной нормальной плазмы использовалась пулированная свежеполученная обедненная тромбоцитами плазма от 5-10 практически здоровых людей в возрасте от 18 до 35 лет. Последняя применялась для расчетов отношения и нормализованного отношения (НО) при оценке результатов методов, обозначенных в таблице под №№ 2.1-2.3, 2.5, 2.7-2.9, 4.5, 6.3, 6.4, 6.7, 7.1-7.5, согласно инструкции по применению соответствующих наборов реагентов.

Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программ Microsoft Office Excel 2003, Statistica 6.1. По большинству исследованных показателей отмечалось ненормальное распределение в выборке, в связи с чем применялся непараметрический метод анализа. Для показателей каждого теста на разных этапах обследования были рассчитаны медиана и референтные интервалы (2,5‰ — 97,5‰) в соответствии с ГОСТ Р53022-3 – 2008 [18].

Результаты и обсуждение
Полученные результаты, в целом, выявили нарастающую активацию свертывания крови и фибринолиза в системном кровотоке (и блокирование пристеночного фибринолиза) у беременных женщин по мере увеличения сроков гестации, что было продемонстрировано следующими наблюдениями (таблица).

ДОПУСТИМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ПРОТЕКАЮЩЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ

Примечания: [х] – в надстрочном положении приведено используемое оборудование, АДФ – аденозиндифосфат динатриевая соль, АПТВ – активированное парциальное/частичное тромбопластиновое время, «ВА+» — метод, высокочувствительный к эффектам волчаночного антикоагулянта, «ВА-» — метод, мало чувствительный к эффектам волчаночного антикоагулянта, МЕ – международные единицы, отношение – рассчитывается как частное показателя времени свертывания в опытном образце к показателю в образце контрольной нормальной плазмы, Т-С – Технология-Стандарт, ADAMTS-13 – металлопротеиназа, расщепляющая фактор Виллебранда («a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13»), VIIa – активированный фактор VII.

Как и ожидалось, имелись значительные различия по большинству изученных показателей системы гемостаза (54 параметрам из 89) у беременных женщин в сравнении с аналогичными значениями у практически здоровых, не беременных женщин. С другой стороны, не было найдено достоверно выраженной динамики по таким параметрам, как количество тромбоцитов в крови, уровень 4 пластиночного фактора, агрегационная активность тромбоцитов (за исключением результатов, полученных при использовании низкой конечной дозы АДФ – 0,1 мкмоль/л), содержание эндотелина 1. То же касалось результатов определений в скрининговых коагуляционных тестах, оценки активности факторов XI и XIII и антитромбина III.

В задачи настоящей статьи не входил глубокий анализ всего спектра полученных данных с точки зрения эволюции гемостатического баланса в ходе физиологической беременности и роли его нарушений в проблемах репродукции человека. Это потребует дополнительного времени и иного формата публикации. Осмысление приведенных результатов выполнено лишь по итогам изучения функционирования сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза у беременных [13,19], и работа в этом направлении продолжается.

К особенностям представленного материала можно отнести исследование, в ряде случаев, того или иного показателя системы гемостаза с помощью двух или большего числа тест-систем различных производителей. В число таких показателей вошли скрининговые коагуляционные тесты, определение концентрации фибриногена, антигена фактора Виллебранда, активности антитромбина III, оценка нарушений в системе протеина С, измерение концентрации плазминогена и D-димеров. В частности, уровень D-димеров при беременности оценивался по данным применения четырех диагностических наборов трех фирм-изготовителей, что может представлять несомненный интерес для большого числа специализированных лабораторий. 

интегральных методов исследования системы гемостаза – теста генерации тромбина (калиброванной тромбографии), тромбоэластометрии и при оценке пространственного роста фибринового сгустка по технологии «Тромбодинамика», что не имеет аналогов в мировой литературе. Эти методические подходы имеют хорошие перспективы для использования в рамках переоснащения и модернизации лабораторий, оказывающих диагностическую помощь в учреждениях родовспоможения.

Заключение
В данном исследовании изучен широкий спектр лабораторных показателей, имеющих отношение к функционированию системы гемостаза на разных сроках физиологически протекающей беременности, а также в первые дни после естественного родоразрешения. Эти данные могут быть использованы в качестве ориентировочных при обследовании беременных женщин и учитываться при отборе пациенток высокого риска по тромботическим, геморрагическим и акушерским осложнениям.

ЛИТЕРАТУРА:

Серов В.Н., ред., Сухих Г.Т., ред. Клинические рекомендации. Акушерство и гинекология. 4-е изд., перераб. и доп. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2014. 
Савельев В.С., Чазов Е.И., Гусев Е.И., Кириенко А.И., Акчурин Р.С., Андрияшкин В.В. и др. Российские клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике венозных тромбоэмболических осложнений. Флебология. 2010; 4(1): 2-37. 
Brenner B. Haemostatic changes in pregnancy. Thromb Res. 2004; 114: 409-414. 
Franchini M. Haemostasis and pregnancy. Thromb Haemost. 2006; 95: 401-413.
Бицадзе В.О, Макацария А.Д., Хизроева Д.Х., Макацария Н.А., Яшенина Е.В. Тромбофилия как важнейшее звено патогенеза осложнений беременности. Практическая медицина. 2012; 5(60): 22-29. 
Braekkan SK., Mathiesen EB., Njølstad I., Wilsgaard T, Hansen JB. Hematocrit and risk of venous thromboembolism in a general population. The Tromso study. Haematologica. 2010; 95: 270-275. 
Heit J. Thrombophilia: Clinical and Laboratory Assessment and Management. In: Kithens C.S., Kessler C.M., Konkle B.A. Consultative Hemostasis and Thrombosis. 3rd ed. Philadelphia: Saunders Elsevier; 2013: 205-239.
Момот А.П., Молчанова И.В., Цхай В.Б. Фармакотерапия массивных акушерских кровотечений. Акушерство и гинекология. 2010; 4: 3-10. 
Momot A., Molchanova I., Tskhai V., Mamaev A. Pharmacotherapy of Massive Obstetric bleedings as Alternative to hysterectomy. In: Ayman Al-Hendy and Mohamed Sabry., eds. Hysterectomy. Croatia: Intech; 2012: 197-222.
Бышевский А.Ш., Полякова В.А., Рудзевич А.Ю. Гемостаз при физиологической беременности, беременности с артериальной гипертензией и преэклампсией. Тромбоз, гемостаз и реология. 2010; 4(44): 13-30.
Abbassi-Ghanavati M., Greer LG., Cunningham FG. Pregnancy and laboratory studies: a reference table for clinicians. Obstet Gynecol. 2009; 114: 1326-1331.
Szecsi P.B., Jǿrgensen M., Klajnbard A., Andersen M.R., Colov N.P., Stender S. Haemostatic reference intervals in pregnancy. Thromb Haemost. 2010; 103(4): 718-727.
Момот А.П., Кирющенков П.А., Трухина Д.А., Тараненко И.А., Томилина О.П., Пыхтеева М.В. и др. Референтные значения уровня и активности фактора Виллебранда, металлопротеиназы ADAMTS-13, активности тромбоцитов при физиологически протекающей беременности. Акушерство и гинекология. 2014; 2: 46-52.
Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. 3-е. изд. М.: Ньюдиамед; 2008. 
Момот А.П., ред., Цывкина Л.П., Тараненко И.А. Мамаев А.Н., Сердюк Г.В., Шахматов И.И. и др. Современные методы распознавания состояния тромботической готовности. Барнаул: Изд-во Алтайского государственного университета; 2011. 
Harrison P., Mackie I., Mumford A., Briggs C., Liesner R., Winter M. et al.; British Committee for Standards in Haematology. Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function. Br. J. Haematol. 2011; 155(1): 30-44.
Key N., Makris M., O’Shaughnessy, Lillicrap D., eds. Practical Hemostasis and Thrombosis. 2 rd ed. Oxford: Blackwell publishing Ltd; 2009. 
ГОСТ Р53022-3-2008. Технологии лабораторные и клинические. Требования к качеству лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической эффективности лабораторных тестов. М.: 2008.
Момот А.П., Трухина Д.А., Тараненко И.А., Романов В.В. Особенности сосудисто-тромбоцитарного гемостаза на разных сроках физиологической беременности. Медицинский алфавит. Современная лаборатория. 2014; 1(2): 27-31.