Аннотация
Методом агаровых слоев из фекалий детей и взрослых выделены высоко-антагонистические по отношению к ряду патогенных и условно-патогенных бактерий штаммы лактобацилл. Установлены высокая чувствительность культур к антибиотикам широкого спектра действия и достаточная степень адгезивности. Выявлены ингибирующие и стимулирующие концентрации соляной кислоты и желчи. Считают, что комплекс биологических свойств выделенных лактобацилл открывает перспективы дальнейшего поиска лактобацилл-пробиотиков.
Ключевые слова: лактобациллы, антибиотикучувствительность, патогенность, адгезивность, чувствительность к HCl и желчи, персистенция.
1. Введение
Пробиотические бактерии должны обладать набором свойств, позволяющих им конкурировать с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. К таким признакам относятся: антагонистическая активность, способность адгезии к эпителиоцитам кишечника, активность кислотообразования, определенный уровень резистентности к соляной кислоте и желчи, отсутствие факторов патогенности и др. (Бондаренко В.М., Воробьев А.А., 2004). Известно, что представители рода Lactobacillus способны синтезировать антимикробные вещества, ассоциированные с синтезом бактериоцинов. В отличие от антибиотиков, бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия, направленный против родственных видов. (Блинкова Л.П., 2006, Jamuna M., 2004).
В связи с этим, актуальной является селекция штаммов лактобацилл, синтезирующих бактериоцины и микроцины с широким спектром антагонистической активности, обладающих биологическими свойствами, обеспечивающими безопасность и эффективность их применения.
3. Материалы и методы
Выделение лактобактерий осуществляли путем посева разведений фекалий на элективную среду – лактобакагар. Посевы культивировали в микроаэрофильных условиях. Антагонистическую активность лактобактерий выявляли методом агаровых слоев по отношению к тест-культурам Staphylococcusaureus, Bacillus mycoides, Pseudomonasaeruginosa,Salmonellatyphimurium, Candida albicans и др. Через сутки культивирования в термостате при 37° положительный результат учитывали по появлению вокруг бляшек зон отсутствия роста в мм.
В поисках штаммов лактобактерий – антагонистов условно-патогенной и патогенной микрофлоры обследовано 37 человек в возрасте от 5 мес. до 42-х лет, их них 54% составили дети до 14 лет. Выделено 65 штаммов лактобактерий.
2. Результаты и обсуждение
Антагонистической активностью к 6 культурам бактерий обладали 43 штамма (69%): слабыми антагонистами оказались 35% лактобактерий, средней степени – 61% и сильными лишь 4,6% штаммов. Наиболее высокой антагонистической активностью лактобактерии обладали к E. coli и Bac. mycoides. По отношению к C. albicans отмечен лишь слабый антагонизм у всех 43-х изолятов лактобактерий. Среднюю степень антагонизма демонстрировали более 50% испытуемых культур лактобактерий к E. сoli, S. aureus, Ps. aeruginosa, S. typhimurium, Bac. mycoides.
Не установлено достоверных различий в преобладании лактобактерий с сильными антагонистическими свойствами в зависимости от возраста. Отмечена лишь тенденция к повышению частоты выделения таких штаммов у детей раннего возраста.
Из всего комплекса биологических свойств бактерий практически наиболее важной является антибиотикочувствительность. Нами установлена чувствительность лактобацилл к бензилпенициллину, хлорамфениколу, ампицилину, тетрациклину, амоксициллину, кларитромицину, карбенициллину, эритромицину и левомицетину. Более высокая чувствительность лактобацилл к антибиотикам широкого спектра действия может быть использована при создании препарата — пробиотика без риска передачи генов лекарственной устойчивости.
При изучении чувствительности антагонистически активных штаммов лактобацилл к антисептикам выявлена 100% чувствительность к раствору Люголя, 60% — к 0,5% раствору метиленовой сини и 20% — к 0,5% раствору диоксидина.
У изученных штаммов отсутствовали ферменты патогенности, ответственные за гемолитическую, казеинолитическую, лецитиназную, желатиназную, гилуронидазную, антилизоцимную, дезоксирибонуклеазную и рибонуклеазную активности. Эти данные свидетельствуют о безопасности лактобацилл при использовании в качестве пробиотиков.
Для изучения способности лактобацилл к длительной персистенции в ЖКТ была исследована их адгезивная активность на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+. Установлено, что средний показатель адгезии колебался от 1,04 до 5,68 и в среднем составил 2,54±1,19 (по В.И. Брилис). Таким образом, лактобациллы имели среднее значение адгезивности, что указывает на способность лактобацилл обеспечивать колонизационную резистентность в ЖКТ без транслокации во внутренние органы.
Исследована чувствительность лактобацилл к соляной кислоте и желчи для изучения их устойчивости к защитным факторам гастроинтестинального тракта. Скорость размножения исследуемых лактобактерий характеризовалась величиной оптической плотности растущих бульонных культур, которая сравнивалась с контролем, где происходило размножение исследуемого штамма в отсутствие соляной кислоты и желчи.
Для большинства штаммов лактобацилл минимальная ингибирующая концентрация соляной кислоты составила 1,25%. При концентрации HCl 0,625% наблюдался подъем роста всех исследуемых штаммов лактобацилл. Возможно, это связано с активацией ферментных систем, отвечающих за метаболические процессы бактерий. Концентрация HCl 0,3125% оказывала ингибирующее действие на лактобациллы, а снижение концентрации соляной кислоты не оказывало существенного влияния на рост микроорганизмов.
При исследовании чувствительности лактобацилл к желчи было установлено, что при любой концентрации желчи наблюдалась стимуляция роста лактобацилл. Наибольшими концентрациями желчи, стимулирующими рост лактобацилл, являлись: 0,625%, 2,5%, 5% и 10%.
Таким образом, биологические свойства, выделенных нами, антагонистических штаммов лактобацилл свидетельствуют об их способности к длительной персистенции в желудочно-кишечном тракте и безопасности, что открывает перспективы дальнейшего поиска штаммов для эффективной коррекции гомеостаза.
Литература
- Блинкова Л.П. Биотехнологические условия синтеза бактериоцинов / Блинкова Л.П., Машенцева Н.Г., Хорольский В.В., Горобец О.Б., Дорофеева Е.С. // Журн. микробиол. – 2006. — №2. – С. 83-89.
- Бондаренко В.М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией / Бондаренко В.М., Воробьев А.А. // Журн. микробиол. – 2004. — №1. – С. 84-89.
- Jamuna M. Isolation and characterization Lactobacilli from some traditional fermented foods and evaluation of the bacteriocins / Jamuna M., Jeevaratnam K. // J. Gen. Microbiol. – 2004. — № 50 (2). – P. 79-90.
Отправить рукопись